用響應曲面法優(yōu)化豌豆蛋白酶解條件

李 慧, 王 琪, 王鑫爍, 周泉城*

(1.山東理工大學農業(yè)工程與食品科學學院食品科學系，山東 淄博 255049；2.農產品功能化技術山東省高校重點實驗室， 山東 淄博 255049)

豌豆(PisumsativumLinn)是我國的主要農作物之一，在我國又被稱為青豆、荷蘭豆、回鶻豆、國豆和畢豆等。豌豆蛋白含有人體必需的所有氨基酸，屬于全價蛋白質。氨基酸比例均衡，其中賴氨酸含量較多，蛋氨酸含量較低，其余的含量均達到FAO/WHO推薦模式值[1]。 目前我國對于豌豆的深加工以淀粉制作粉絲為主，其中的蛋白質隨殘渣沖走，這不僅造成了極大的資源浪費還污染了環(huán)境[2]。研究[3]表明，隨著人們生活水平的不斷提高，蛋白質的需求量也不斷增加，但是卻有許多優(yōu)質的植物蛋白質不能得到有效的利用;因此，急需找到將這部分作為副產物的優(yōu)質植物蛋白資源加工為高附加值產品的方法[4]。

在豌豆的酶解產物中，存在著大量的生物活性肽。這些活性肽對于人體有著一定的益處，具有相當巨大的開發(fā)潛力[5]。豌豆酶解產物中的抗氧化肽、降血壓肽、降血脂肽和抑菌肽等作為純天然的添加劑，可以用于功能性食品的開發(fā)，為豌豆蛋白的綜合利用提供新的研究方向，提高豌豆蛋白的利用率和使用價值[6-7]，使豌豆的應用范圍進一步擴大。

本文以含水量為30%的豌豆蛋白為原料，用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白，以DPPH和·OH自由基清除率為抗氧化評價指標，通過響應曲面試驗優(yōu)化豌豆蛋白的酶解條件并建立酶解產物自由基清除率預測模型，從而為豌豆的開發(fā)利用和加工拓寬思路、提供參考，以提高豌豆的經濟附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆蛋白粉，主要組成為水分4.6%±0.02%，蛋白質73.2%±0.23%，粗脂肪0.22%±0.01%，灰分4.62%±0.03%，購自煙臺雙塔食品股份有限公司；所用試劑均為分析純。

RE200型旋轉蒸發(fā)儀，雅馬拓科技貿易(上海)有限公司；FD-C10N型臺式冷凍干燥機，冠森生物科技(上海)有限公司；WHZ-2 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州市萬豐儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

稱取2 kg豌豆蛋白粉加入一定質量的蛋白酶和一定pH值的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置于恒溫振蕩水浴鍋中，振蕩酶解3 h，結束后，沸水浴滅酶10 min。冷卻后，將蛋白酶解液過濾，取濾液待測[8]。

1.3 豌豆蛋白酶解參數(shù)的響應面優(yōu)化

采用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白，測定其抗氧活性，并利用響應曲面法優(yōu)化其酶解條件。在預實驗的基礎上，固定酶解時間3 h，選取加酶量(A)、溫度(B)、pH值(C)、底物質量分數(shù)(D)為變量進行實驗設計和分析。以豌豆蛋白酶解物的抗氧化活性(DPPH清除率和·OH清除率)為響應值，設計4因素5水平共26個試驗點的響應面分析實驗[9]。實驗方案、實驗條件及結果列于表1中，進而確定最優(yōu)水平，實驗因子及水平見表1。

表1 因素水平表

1.4 酶解產物自由基DPPH清除率的測定

實驗根據(jù)Dike Teng等[10]的方法，加以改動。實驗組取濾液1 mL，加入試管中。并加入4 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，其中DPPH溶液用V95%乙醇∶V蒸餾水=1 ∶1的混合溶液作為溶劑配制。避光靜置30 min后，在517 nm下測定吸光度(Asample)。

對照組以1 mL的蒸餾水代替濾液，實驗步驟與上述相同(Acontrol)?？瞻捉M以V95%乙醇∶V蒸餾水=1 ∶1的混合溶液來代替DPPH溶液，實驗步驟與上述相同(Ablank)。參比為1 mL蒸餾水和4 mL的V5%乙醇∶V蒸餾水=1 ∶1的混合溶液。

計算公式如下：

清除率=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%。

1.5 酶解產物自由基·OH清除率的測定

根據(jù)鄰二氮菲法[11]，做適當修改。實驗組取2 mL濾液置于試管中，加入2 mL的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.4)，再加入1 mL 1.8 mmol/L的鄰二氮菲溶液和1 mL 1.8 mmol/L的FeSO4水溶液，迅速混勻。最后在混合液中加入1 mL質量分數(shù)為0.02%的雙氧水，于37 ℃下水浴60 min，冷卻后在536 nm下測定吸光度，記為As。

對照組以蒸餾水代替濾液，實驗步驟與上述相同(Ac)。空白組用蒸餾水代替濾液和雙氧水，實驗步驟與上述相同(Ab)。參比為5 mL的磷酸鹽緩沖溶液與2 mL蒸餾水的混合溶液。

計算公式如下：

清除率%=[(As-Ac)/(Ab-Ac)]×100 %。

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個操作3次平行。利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程，對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，Duncan test確定平均值差異。

2 實驗結果與分析

2.1 響應面試驗結果與分析

在預實驗的基礎上，選取加酶量(A)、溫度(B)、pH(C)、底物質量分數(shù)(D)為實驗因素，以酶解物的自由基清除率為評判指標，設計4因素5水平共26個試驗點的響應分析實驗進行二次回歸設計實驗和分析。實驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

以DPPH清除率為響應值，經回歸擬合后，中性蛋白酶酶解豌豆蛋白的DPPH清除率的回歸方程為：

DPPH清除率=-2472.63366+30.33958·A+469.80509·B+102.95417·C+102.95417·D+0.13519·AB+0.95521·AC-1.35781·AD+0.17625·BC-0.44938·BD-5.93542·CD-1.56237·A2-0.24633·B2-31.75810·C2-2.10698·D2。

中性蛋白酶酶解豌豆蛋白的DPPH清除率的回歸方程方差分析如表3所示。

表3 DPPH清除率方差分析

由表3可以得出，所建模型是顯著的，失擬項是不顯著的，說明無失擬因子存在，該模型與真實測量值擬合良好，且加酶量(A)和pH的二次項(C2)影響顯著，加酶量的二次項(A2)、溫度的二次項(B2)影響極顯著。說明在中性蛋白酶酶解豌豆蛋白過程中，加酶量、pH、加酶量的二次方、溫度的二次方對DPPH清除率有顯著影響。由F值可知，F(xiàn)越大對豌豆蛋白酶解度的影響就越大，所以各因素對豌豆蛋白酶解液DPPH清除率的影響次序：加酶量(A)>底物質量分數(shù)(D)>酶解溫度(B)>pH(C)。加酶量和底物質量分數(shù)對酶解度的交互作用比其他交互作用更明顯。根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對DPPH清除率影響的響應曲面圖(見圖1)。

通過響應曲面圖1，可以進一步看出加酶量、pH、溫度、底物質量分數(shù)，任何兩因素對DPPH清除率的交互影響。由上圖可以看出4因素值選擇合理，驗證了實驗的準確性。DPPH清除率隨著底物質量分數(shù)的增加而增加最終趨于平緩；而隨著加酶量、pH、溫度的升高先升高后降低。

以·OH清除率為響應值，經回歸擬合后，中性蛋白酶酶解豌豆蛋白的·OH清除率的回歸方程為：

圖1 DPPH清除率響應曲面圖

·OH清除率=-2247.04903+30.15021·A+17.29758·B+438.60694·C+86.07625·D+0.14113·AB+0.46667·AC-1.19375·AD+0.39500·BC-0.47450·BD-4.67083·CD-1.44422·A2-0.22852·B2-30.39583·C2-1.57437·D2。

中性蛋白酶酶解豌豆蛋白的·OH清除率的回歸方程方差分析如表4所示。

由表4可知，所建模型是顯著的，失擬項是不顯著的，說明該模型與真實測量值擬合良好。且加酶量(A)和加酶量的二次項(C2)影響極顯著。由F值可知，各因素對豌豆蛋白酶解液·OH清除率的影響次序：pH(C)>底物質量分數(shù)(D)>酶解溫度(B)>加酶量(A)。根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對·OH清除率影響的響應曲面圖見圖2。

表4 ·OH清除率方差分析

圖2 ·OH清除率響應曲面圖

由圖2可知加酶量、pH、溫度、底物質量分數(shù)，任何兩因素對·OH清除率的交互影響。由圖2可以看出4因素值選擇合理，驗證了實驗的準確性。

2.2 最佳DPPH、·OH自由基清除率條件

以DPPH清除率、·OH清除率為評價指標，對回歸方程進行偏微分，得出最佳酶解條件：加酶量為10.60%、溫度40.30 ℃、pH 7.02、底物質量分數(shù)為6.80%。在此條件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為99.10%、97.60%。

2.3 驗證實驗

經驗證，在此條件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為97.8%±0.23%、96.2%±0.35%。

3 結論

中性蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的最佳酶解條件：加酶量為10.60%、溫度40.30 ℃、pH 7.02、底物質量分數(shù)為6.80%。在此條件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為99.10%、97.60%。得到了豌豆蛋白酶解產物DPPH、·OH自由基清除率的預測模型，該模型預測準確可靠，可用于生產預測和工藝開發(fā)。

參 考 文 獻

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