稀釋液凍干粉劑低溫超長時(shí)間保存綿羊精液效果

王 杰 ，李 娜 ，肖國亮 ，趙建清 ，高慶華 ，3

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；3.新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；4.新疆喀什地區(qū)畜牧工作站，喀什 844000）

精液低溫保存操作簡單，精子存活率較高，保存效果好，受胎率高。綿羊精液體外長時(shí)間保存在很大程度上打破了時(shí)間、空間對(duì)種公羊種用性能的限制，在實(shí)際生產(chǎn)中最為常用。1961年Nishikawa等［1］在4℃下低溫保存山羊精液15 d，精子在第6天時(shí)仍然有受精能力。2011年Ashrafi等［2］使用冷凍稀釋液保存精液 60 h，精子活率達(dá)到46.4%。鄒宇銀等［3］低溫保存綿羊精液214 h，精子活率達(dá)55%以上；陳曉麗等［4］低溫保存精液

12 d，精子活率達(dá)到49%。低溫保存9 d已經(jīng)屬于超長時(shí)間保存，該稀釋液使綿羊精液低溫超長時(shí)間保存后應(yīng)用于生產(chǎn)成為了可能。傳統(tǒng)綿羊精液低溫保存稀釋劑主要是液態(tài)形式，稀釋液保存、運(yùn)輸比較麻煩。粉劑稀釋液的研究，可以規(guī)范稀釋液的生產(chǎn)流程，降低稀釋液的保存條件，擴(kuò)大稀釋液的適用范圍以及實(shí)現(xiàn)稀釋液的商品化。粉劑稀釋液有固體混合和液體干燥兩種方法，由于本試驗(yàn)所使用原稀釋液中約有20%的卵黃，所以采取冷凍干燥的方法來獲得原稀釋液的凍干粉劑。粉劑稀釋液用于綿羊精液低溫保存的報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)擬利用新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的綿羊精液長期保存的TRIS專利稀釋液，經(jīng)過干燥工藝制成粉劑稀釋液，以進(jìn)行粉劑稀釋液對(duì)綿羊精液低溫長時(shí)間保存的可行性研究。

1 材料與方法

1.1 粉劑稀釋液的制備

使用本實(shí)驗(yàn)室主要成分為三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、三磷酸腺苷、果糖、卵黃的TRIS專利稀釋液，每5毫升分裝到試管中，在－80℃冰箱中冷凍12 h后在真空冷凍干燥器中完全干燥后取出避光保存，稀釋精液前將粉劑稀釋液用雙蒸水定容至5 mL混勻備用。

1.2 精液采集與保存

選取6只4歲體況較好且無繁殖障礙的盤羊與巴什拜羊雜交公羊，在采精前1個(gè)月飼喂胡蘿卜，試驗(yàn)前1周用假陰道法采精3次，試驗(yàn)中將每頭每次假陰道法采集的精液平均分為2份，分別與經(jīng)過干燥處理過的稀釋液（A組）和未經(jīng)過干燥處理稀釋原液（B組）按照1∶4混合，水浴在冰箱中2 h降溫至0℃，并在冰水混合物中保存。

1.3 精液品質(zhì)鑒定

精子活率檢測，在第0、1、3、6、9、12天將粉劑稀釋液組（A組）和原稀釋液組（B組）分別各取5 μL精液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，放在37℃熱臺(tái)上，在400倍顯微鏡下檢測，觀察精子活率并記錄。

精子頂體完整率檢測，在第 0、1、3、6、9、12 天將 A組和B組各吸取一滴精液滴于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片，經(jīng)自然風(fēng)干5～10 min后，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，再經(jīng)水洗干燥后，用姬姆薩染液對(duì)抹片精子染色90 min，再用蒸餾水沖洗、干燥，顯微鏡下觀察頂體完整的精子數(shù)并記錄。

1.4 受胎率檢測

用低溫保存第9天的精液（精子活率大于0.5）對(duì)297只發(fā)情母羊A組（154只）和B組（143只）采用常規(guī)試情和人工授精，40 d用B超統(tǒng)計(jì)受胎情況。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

精子活率和頂體完整率用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，受胎率用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫保存對(duì)綿羊精液精子活率的影響

由表1可知，A、B兩組稀釋劑的精子活率均隨時(shí)間推移逐漸下降，從第3天開始B組平均精子活率均高于A組，且隨著時(shí)間推移差值逐漸變大。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn)，A組與B組低溫保存下精子活率在各時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著（P＞0.05）。在第9天A組和B組精子活率均高于0.5，滿足鮮精輸精要求。

表1 兩組稀釋劑低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的精子活率

2.2 低溫保存對(duì)綿羊精液精子頂體完整率的影響

從表2可見，兩稀釋劑組的精子頂體完整率均隨時(shí)間推移逐漸下降，從第1天開始B組頂體完整率均高于A組，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn)，A組與B組低溫保存下精子頂體完整率在各時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著（P＞0.05）。A、B兩組在第6天到第9天精子頂體完整率下降較快，在第9天兩組頂體完整率均高于65%。

表2 兩組稀釋劑低溫保存綿羊精液不同時(shí)間精子頂體完整率%

2.3 低溫保存對(duì)綿羊精液受胎率的影響

A組低溫保存綿羊精液，在第9天人工授精154只，有103只妊娠，受胎率達(dá)66.9%；B組第9天人工授精143只，有97只妊娠，受胎率67.8%。

3 討論

精子活率是精液品質(zhì)檢測中最重要的檢測指標(biāo)，精子活率的高低直接影響人工授精的成功率。本試驗(yàn)A組與B組在各時(shí)間點(diǎn)的精子活率差異均不顯著（P＞0.05），在試驗(yàn)第12天B組與A組的精子活率分別為0.47±0.04 和 0.44±0.04，略低于陳曉麗等［4］的試驗(yàn)結(jié)果（0.49±0.01），但優(yōu)于孟娜娜等［5］的試驗(yàn)結(jié)果。但 A 組在第9天精子活率為0.53±0.04，可以認(rèn)為粉劑稀釋液在低溫保存9 d內(nèi)精子活率能滿足輸精要求。

頂體反應(yīng)是哺乳動(dòng)物受精的重要環(huán)節(jié)，只有具有完整頂體的精子才有受精的可能。本試驗(yàn)A組與B組在各時(shí)間點(diǎn)的精子頂體完整率差異均不顯著（P＞0.05），A組在第6天的頂體完整率（85.1±1.1）%優(yōu)于趙金紅等［6］保存5 d的頂體完整率，但隨時(shí)間推移頂體完整率逐漸下降，在第6天以后頂體完整率下降速度加快。薛昌安［7］的研究結(jié)果表明，在第6天以后滲透壓對(duì)綿羊精子頂體完整率的影響差異顯著（P＜0.05），且隨著時(shí)間推移不同滲透壓之間差異逐漸變大［8］。與本試驗(yàn)頂體完整率在保存6 d以后迅速下降的試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)還表明，A、B兩組精子在低溫保存第9天的頂體完整率仍然均高于65%。

人工授精是現(xiàn)代化飼養(yǎng)管理中非常重要的繁殖技術(shù)，受胎率的高低是對(duì)人工授精結(jié)果的直接反映。在經(jīng)過精液品質(zhì)檢測后發(fā)現(xiàn)第9天A組與B組精子活率均高于0.5，且頂體完整率均高于65%，所以本試驗(yàn)用低溫保存第9天時(shí)的精液對(duì)297只發(fā)情綿羊進(jìn)行人工授精，A組與B組的受胎率分別為66.9%和67.8%。本試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于譚建寧等［8］使用凍精人工授精和白丁平等［9］使用1.2億有效精子數(shù)鮮精的受胎率，低于王柏山等［10］使用鮮精的受胎率（76.6%）?？赡苁求w外保存時(shí)間較長精子受精能力減弱，或因?yàn)檩斁行Ь訑?shù)不同。所以，本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用本實(shí)驗(yàn)室專利綿羊稀釋液經(jīng)過干燥處理制成粉劑，對(duì)精子保存能力與原稀釋液差異不顯著（P＞0.05），說明稀釋液凍干粉劑能夠?qū)d羊精液進(jìn)行低溫長時(shí)間保存。

4 結(jié)論

粉劑稀釋液與原稀釋液低溫長時(shí)間保存綿羊精子，在保存第9天精子活率均能夠達(dá)到0.5，頂體完整率均高于65%，粉劑稀釋液與原稀釋液對(duì)精子活率和頂體完整率的保護(hù)能力無明顯差異；粉劑稀釋液與原稀釋液在低溫保存精液的第9天后進(jìn)行人工授精，受胎率分別為66.9%和67.8%，差異不顯著（P＞0.05）。表明粉劑稀釋液可以替代液體稀釋液低溫保存綿羊精子并進(jìn)行人工授精。

［1］Nishikawa Y，Torigai Y，Tachikawa M，et al.Experiments on conception with spermatozoa preserved with neospmnan prepared exclusively for goat use［J］.Anim，1961，21（1）：67-73.

［2］Ashrafi I，Kohram H，Naijian H，et al.Protective effect of melatonin on sperm motility parameters on liquid storage of ram semen at 5 degrees C［J］.Afr J Biotechnol，2011，10（34）：6670-6674.

［3］鄒宇銀，馬夢婷，安丹，等.綿羊鮮精長效保存稀釋液海藻糖濃度優(yōu)化試驗(yàn)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（13）：107-109.

［4］陳曉利，鄭永富，王杰，等.超長時(shí)間低溫保存綿羊鮮精活率和DNA完整性的比較［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（20）：90-92.

［5］孟娜娜，孫樹春，王寒陽，等.綿羊精液4℃液態(tài)保存的稀釋液配方優(yōu)化研究［J］.中國畜牧雜志，2015，51（5）：34-38.

［6］趙金紅，彭海梅，周鵬，等.酉州烏羊精液品質(zhì)評(píng)定及稀釋液配方研究［J］.中國草食動(dòng)物科學(xué)，2014，34（S1）：210-213.

［7］薛昌安.山羊精液保存技術(shù)研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［8］譚建寧，莫廷新.陶賽特肉羊細(xì)管凍精人工授精受胎率的觀察［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2008（5）：18-19.

［9］白丁平，田秀娥，陳玉林，等.綿羊同期發(fā)情下有效精子數(shù)與不返情率關(guān)系研究［J］.中國草食動(dòng)物，2005，25（5）：16-18.

［10］王柏山，蓋長青.綿羊精液多倍稀釋母羊受胎效果［J］.中國養(yǎng)羊，1995（1）：23-24.