牛源糞腸球菌esp基因的表達及生物信息學(xué)分析

高 昇 ，楊宇澤 ，馬 倩 ，樊 杰

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見而且危害最為嚴(yán)重的三大疾病之一，也是對乳品加工業(yè)危害最大的疾病。奶牛乳房炎多發(fā)生于產(chǎn)后期，其中最主要的因素是病原微生物感染［1］。臨床實驗研究已發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）等環(huán)境致病菌在奶牛乳房炎發(fā)生中作用明顯［2］。

esp（Enterococcus surface protein，esp）是編碼糞腸球菌表面蛋白的基因，GenBank序列號為AF034779，全長5 791 bp。esp結(jié)構(gòu)獨特，核心區(qū)域由多個堿基序列重復(fù)組合而成，其所編碼的表面蛋白是腸球菌眾多致病因素之一，其在腸球菌對宿主細(xì)胞的黏附定植和逃避宿主免疫清除方面起到一定作用［3］。腸球菌表面蛋白是腸球菌表面分子量最大的一種蛋白質(zhì)，屬于黏附素的一種，與腸球菌在內(nèi)置導(dǎo)管表面形成生物膜有關(guān)，在腸球菌感染時有利于延長致病菌在感染動物體內(nèi)的停留時間，但本身并不損傷宿主細(xì)胞［4］，腸球菌表面蛋白因核心氨基酸重復(fù)次數(shù)不同而大小不一，在感染初期大分子腸球菌表面蛋白有利于腸球菌對宿主細(xì)胞的黏附，定植完成后，小分子腸球菌表面蛋白有利于腸球菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用［5］。

傳統(tǒng)的抗生素治療常常因為耐藥性而療效不佳，同時造成嚴(yán)重的乳中抗生素殘留而危害人類健康。因此，近些年來人們開始研究和開發(fā)有效的免疫制劑來防制乳房炎。研究表明，牛源糞腸球菌（Bovine Enterococcus faecalis）溶血素基因（cylA）、表面蛋白基因（esp）、膠原蛋白黏附素基因（ace）、心內(nèi)膜炎有關(guān)抗原基因（efaA）等在奶牛乳房炎的發(fā)展過程中具有重要作用，被認(rèn)為是疫苗發(fā)展的良好靶位點［6-7］。由于esp較大，很難在體外完全表達，筆者等通過基因克隆得到esp的部分CDS，并將esp與載體相連接構(gòu)建原核表達載體，并分析esp及其編碼蛋白的信息，為奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 牛源糞腸球菌、質(zhì)粒pBluescriptⅡKS（+）、克隆菌株E.coli DH5α和表達菌株E.coli BL21為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)大腸埃希氏菌DH5α、BL21的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，2×YT培養(yǎng)基用于重組菌的誘導(dǎo)。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自TaKaRa公司；pfu酶和T4 DNA Ligase購于Thermo fisher公司；鎳柱購自GE公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、膠回收試劑盒購自于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照GenBank中糞腸球菌esp序列（序列號AF034779）設(shè)計引物，并送金唯智科技有限公司合成。引物序列如下：

F：5'-CCGCTCGAG AAATCGTTTCTCCAGGTTTTGA-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點）；R：5'-CGGGATCCTTGAGGTTTATTCGGTGCTTTT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點）。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 糞腸球菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集菌體后采用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.3 esp基因擴增 以糞腸球菌基因組為模板應(yīng)用pfu酶進行擴增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性8 min，94℃30 s，48℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共 35 個循環(huán)；72℃再延伸 10 min；PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化，將回收后PCR產(chǎn)物和用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切過的pBluescriptⅡKS（+）質(zhì)粒通過T4 DNA Ligase進行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，篩選陽性克隆命名為pBluescriptⅡKS::esp。

1.2.4 原核表達載體的構(gòu)建 將測序正確的pBluescriptⅡKS::esp和pET-28a同時經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切，酶切后的目的片段與pET-28a通過T4 DNA Ligase進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α接感受態(tài)細(xì)胞，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-28a::esp，并送金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.5 重組蛋白的表達及純化 將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28::esp轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后按1∶100比例轉(zhuǎn)接入100 mL 2×YT（Kan+）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2.5h至菌液OD值（600nm）達到0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在26℃誘導(dǎo)表達12 h，7 000 r/min離心10 min，收集菌體，PBS洗滌2次后超聲波破碎30 min（40%，工作5 s，間歇5 s），7 000 r/min離心10 min。收集上清，用GE公司的Ni-NTA柱進行蛋白純化，以誘導(dǎo)前的重組菌株為對照進行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白表達情況。

1.2.6 esp序列及其編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析選取esp序列，利用在線軟件Prot-Param（http：//www.expasy.org/tools）分析該基因序列編碼氨基酸序列組成與理化性質(zhì)；應(yīng)用軟件ProtScale（http：//www.espasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析其氨基酸殘基疏水性；應(yīng)用軟件 TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜區(qū)；應(yīng)用軟件NetPhos 2.0 Serve（http：//www.cbs，dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測磷酸化位點；利用軟件 NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/Services/NetNGlyc/）和 NetOGlyc 3.1 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預(yù)測糖基化位點；利用軟件SignalP3.0（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預(yù)測蛋白信號肽；利用軟件PORTER（http：//distill.ucd.ie/porter）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用EMBOSS中的antigenic（http：//emboss.bioinfo-rmatics.nl/cgi-bin/emboss/anigenic）及在線軟件SYFPEITHI和ProPred預(yù)測抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 esp基因的克隆和表達載體的構(gòu)建

通過PCR方法克隆得到了糞腸球菌的部分esp，將得到的部分esp連接到pET-28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a::esp經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗證無誤后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，PCR結(jié)果和質(zhì)粒雙酶切驗證圖譜表明成功構(gòu)建了表達載體（圖1）。最后對重組質(zhì)粒pET-28a::esp進行測序，測序結(jié)果表明，選取的部分esp大小為3 795 bp，所得esp序列與GenBank登錄號（AF034779）序列比對同源性為68%。

圖1 目的基因的PCR擴增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒雙酶切

2.2 esp誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE電泳

pET-28a::esp重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎后進行純化，得到esp，進行SDS-PAGE電泳檢測。SDSPAGE分析表明，誘導(dǎo)前無特異條帶，誘導(dǎo)后出現(xiàn)特異條帶，純化后在110 ku附近出現(xiàn)單一條帶。詳見圖2。

圖2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 esp序列及其編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析

2.3.1 esp序列及編碼蛋白序列的分子特征 通過DNAMAN和在線軟件EXPASY分析得到選取的部分esp，長度為 3 795 bp，其中 A 堿基 1 475個（38.87%）、T堿基 816個（21.50%）、G 堿基 844個（22.24%）、C堿基660個（17.39%），G+C占39.63%，A+T占60.37%。esp編碼1 207個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約110 ku，等電點為9.67，總共包括19 799個原子，分子式為C6132H10027N1741O1848S51。在組成esp蛋白的20種氨基酸中，谷氨酸（Glu）所占比例最高，達到11.4%，而胱氨酸（Cys）所占的比例最低，為0.7%。

2.3.2 esp編碼蛋白質(zhì)的疏水性分析 蛋白質(zhì)的疏水性在其三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起重要作用。利用軟件ProtScale對esp編碼氨基酸殘基進行疏水性分析，結(jié)果表明，其疏水性最大值為3.500，最小值為-3.267，脂肪系數(shù)為82.34，總平均親水性為-0.713，不穩(wěn)定指數(shù)為43.99，表明為親水蛋白。潛在的親水區(qū)為8～54、71～79、92～114、186～350、361～502、515～536、581～611、623～813、819～836、843～977、983～1 113、1 119～1 192、1 200～1 203位氨基酸，其中623～813位氨基酸親水性強。疏水區(qū)分別位于 1～7、55～70、80～91、115～185、351～360、503～514、537～580、612～622、814～818、837～842、978～982、1 114～1 118、1 193～1 199 位氨基酸，其中 55～70位氨基酸疏水性最強。

2.3.3 esp基因編碼蛋白跨膜區(qū)、信號肽、糖基化位點、磷酸化位點的預(yù)測 經(jīng)預(yù)測，esp蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)可能存在區(qū)域為1～200位氨基酸，不存在信號肽，有6個肽糖基化位點分別位于 504、749、759、823、905、987。細(xì)胞內(nèi)參與磷酸化的氨基酸殘基主要有Thr、Tyr、Ser。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)潛在磷酸位點閾值取0.5時，esp蛋白潛在的磷酸位點有108個（52個Thr位點，分別位于45、117、347、646、849、950、999、1 109 等位氨基酸；44 個Ser位 點 ，分 別 位 于 57、158、200、440、540、654、756、1 196等位氨基酸；12個Tyr位點，分別位于803、861、942、1 049等位氨基酸）。

2.3.4 esp基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用Predict Protein工具分析及PORTER軟件預(yù)測esp的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)esp二級結(jié)構(gòu)以α－螺旋、無規(guī)則卷曲和β－折疊為主，屬于混合型蛋白（圖3）。同時對esp在表皮葡萄球菌、屎腸球菌中編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)氨基酸殘基進行比較發(fā)現(xiàn)，esp在糞腸球菌中的無規(guī)則卷曲和β-折疊比在表皮葡萄球菌略多一些（表1）。應(yīng)用SWISS-M ODEL/SWISS-PdbView等工具，按照同源建模法構(gòu)建出esp基因在表皮葡萄球菌、屎腸球菌中所編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)具有較大的不同（圖4）。

圖3 esp基因編碼二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

表1 esp在屎腸球菌、表皮葡萄球菌所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)比較

2.3.5 esp的抗原表位分析 經(jīng)過EMBOSS中的antigenic網(wǎng)站在線預(yù)測esp的B淋巴細(xì)胞抗原表位。預(yù)測結(jié)果如圖5所示，esp的B淋巴細(xì)胞抗原表位分別位于1～32、62～72、78～114、144～154、162～196、226～236、242～316、324～332、336～398、402～410、418～424 位氨基酸。

分別用SYFPEITHI和ProPred對esp編碼的T淋巴細(xì)胞抗原表位進行預(yù)測分析。其中應(yīng)用SYFPEITHI分析時，一般認(rèn)為，得分在前2%的多肽成為抗原肽的可能性超過80%，esp有1 207個氨基酸，所以得分取靠前的24個抗原多肽作為優(yōu)勢抗原（表2）。ProPred預(yù)測結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，VLMQTLVLL、LILLTLLIV和LTLLIVRKV在兩種軟件中預(yù)測結(jié)果均在前24位氨基酸，所以確定 VLMQTLVLL、LILLTLLIV和 LTLLIVRKV為esp的最佳MCHⅠ類分子抗原表位。

圖4 esp編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 esp編碼蛋白B淋巴細(xì)胞的抗原表位預(yù)測

表2 esp編碼蛋白T淋巴細(xì)胞的抗原表位預(yù)測（SYFPEITHI軟件）

表3 esp編碼蛋白T淋巴細(xì)胞的抗原表位預(yù)測（ProPred軟件）

3 討論

腸球菌表面蛋白是分子量最大的一種腸球菌表面蛋白質(zhì)，屬于黏附素。研究表明，esp位于腸球菌致病島的基因簇里，是腸球菌主要的毒力因子之一，主要與腸球菌對宿主細(xì)胞的定值、黏附、產(chǎn)生生物被膜及宿主免疫清除逃逸有關(guān)。esp基因結(jié)構(gòu)獨特，核心區(qū)域由多個堿基序列重復(fù)組合而成，也被稱為A重復(fù)，A重復(fù)的3＇端是相鄰的2個B重復(fù)序列，B重復(fù)序列緊接著是8個C重復(fù)序列，第8個C重復(fù)序列位與其他的C重復(fù)序列的前30個核苷酸相同。C末端的156-殘基編碼序列可編碼一個跨膜形疏水區(qū)及一個有較小變異的LPXTGX基因序列［8］。研究表明，成熟的esp存在特殊的重復(fù)結(jié)構(gòu)，串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成核心區(qū)，并且擁有大量高度保守的重復(fù)片段［9］。本研究通過生物信息學(xué)對部分esp編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進行了分析，結(jié)果顯示選取的部分esp長度為3 795 bp，編碼1 207個氨基酸，其中谷氨酸（Glu）所占比例最高，達到11.4%，而胱氨酸（Cys）所占的比例最低，為0.7%。esp為酸性親水性蛋白，有利于后續(xù)的異源性表達，其跨膜結(jié)構(gòu)可能存在區(qū)域為1～200位氨基酸，說明該蛋白可能是表面結(jié)構(gòu)蛋白，不存在信號肽，說明esp為非分泌蛋白。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不僅是一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的樞紐，也是預(yù)測三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵點，經(jīng)過預(yù)測esp蛋白二級結(jié)構(gòu)以α－螺旋、無規(guī)則卷曲和β－折疊為主，屬于混合型蛋白［10］，通常，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域決定蛋白的功能，可能與抗原表位有關(guān)［11］。較多的α-螺旋的氨基酸殘基的存在有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，β-折疊中存在脯氨酸，增加了蛋白質(zhì)的剛性，無規(guī)則卷曲氨基酸殘基的存在位點則與形成抗原表位有關(guān)［12］。轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)比較松散，易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，因此，該區(qū)域常含B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位［13］。本研究結(jié)果表明，esp抗原指數(shù)較高，具有親水性，esp抗原表位應(yīng)該是優(yōu)勢抗原表位所在。

［1］李方華，馮士彬，李孝文.奶牛乳房炎的發(fā)病機理及防治研究進展［J］.中國動物保健，2008（8）：40-42.

［2］Patrick K D，Usuf K，Hannington B，et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility patterns of bacteria from milkmen and cows with clinical mastitis in and around Kampala，Uganda ［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63413.

［3］Coque，Teresa M，Willems，et al.High occurrence of esp among ampicillin-resistant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients［J］.The Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2002，50（6）：1035.

［4］馬立艷，許淑珍，馬紀(jì)平.腸球菌致病機制的研究進展［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15（3）：356-360.

［5］強華，林建銀，蔣明森，等.腸球菌溶血素與其致病力的關(guān)系［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2001，17（6）：67-80.

［6］狄婷婷，高原.糞腸球菌主要毒力因子研究進展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2012（3）：231-234.

［7］De V S，Barkema H W，Stryhn H，et al.Impact of early lactation somatic cell count in heifers on milk yield over the first lactation［J］.Journal of Dairy Science，2005，88（3）：938.

［8］Shankar V，Baghdayan A S，Huycke MM，et al.Infection-derived Enterococcus faecalis strains are enriched in esp，a gene encoding a novel surface protein［J］.Infection&Immunity，1999，67（1）：193.

［9］Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et al.The enterococcal surface protein，Esp，is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation［J］.Applied&Environmental Microbiology，2001，67（10）：4538.

［10］Skolnick J，F(xiàn)etrow J S.From genes to protein structure and function：novel applications of computational approaches in the genomic era［J］.Trends in Biotechnology，2000，18（1）：34.

［11］宋建勛，朱錫華，陳克敏.人Fas抗原表位預(yù)測［J］.免疫學(xué)雜志，1999，15（1）：14-16.

［12］Scandurra R，Consalvi V，Chiaraluce R，et al.Protein thermostability in extremophiles［J］.Biochimie，1998，80（11）：933-941.

［13］Blythe M J，F(xiàn)lower D R.Benchmarking B cell epitope prediction：Underperformance of existing methods［J］.Protein Science A Publication of the Protein Society，2005，14（1）：246.