SCNT牛胚胎中PWS/AS基因簇母源印記控制區(qū)甲基化模式研究

王 巍，方東輝，付茂忠，甘 佳，唐 慧，石 溢，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066）

基因組印記（Genomic imprinting），又稱為遺傳印記（Genetic imprinting），是指在配子期或合子期，來自親本（父源或母源）的等位基因或染色體發(fā)生特異性的修飾，導致不同親本來源等位基因具有不同表達活性的一種不遵從孟德爾定律的單親性特殊遺傳現(xiàn)象［1-2］。絕大多數(shù)的印記基因都是成簇存在的；在印記簇中的印記基因的表達或沉默是由印記控制區(qū)（Imprinting control regions，ICRs）通過順式作用來調控的［3］。ICRs實質為一段差異性甲基化區(qū)域（Differentially methylated regions，DMRs），這種差異性甲基化一般是在生殖細胞中建立的，以調控整個印記基因簇的基因沉默情況［4］。因此，印記基因簇可以分為兩種，即在卵母細胞發(fā)生過程中進行修飾而產(chǎn)生的母源印記以及在精子發(fā)生過程中進行修飾而產(chǎn)生的父源印記［5-6］。

普-威綜合征（Prader-Willi syndrome，PWS）和安吉爾曼綜合征（Angelman syndrome，AS）是兩種先天性的神經(jīng)行為發(fā)育異常綜合癥。這兩種疾病的臨床癥狀和遺傳形式雖不相同，但病因都與人類染色體15q11～13區(qū)域的母源性印記基因簇有關。PWS/AS基因簇包含

PWS和AS兩個亞區(qū)，其中PWS亞區(qū)又包含有5個父源表達的蛋白編碼基因，即MKRN3、MAGEL2、NDN、SNURF 和 SNRPN［7］。PWS/AS 基因簇的 ICRs區(qū)由 PWSIC和AC-IC兩部分組成；PWS-IC被定位于包括SNRPN的啟動子和外顯子1的4.3 kb區(qū)域內［8］，而AC-IC區(qū)則被定位于SNRPN基因轉錄起始點上游35 kb前的880 bp區(qū)域內［9］。敲除父源性的PWS-IC區(qū)可致PWS亞區(qū)所有父源基因表達的沉默［10］。PWS/AS基因簇等母源印記區(qū)是良好的分子標簽。應用甲基化測序方法檢測克隆動物早期胚胎中這些印記區(qū)的甲基化水平，并與體外受精胚胎進行比較，可直觀地了解克隆胚中母源染色體的甲基化模式，也可為提高克隆胚胎的成功率提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

處于配子期（受精后8 h或激活后5 h）、S期、2-cell期、8-cell期和桑葚期的西門塔爾牛體外受精（IVF）胚胎和體細胞核移植（SCNT）胚胎每個時期各40枚，由四川農業(yè)大學動物遺傳育種與繁殖實驗室提供。

1.2 總DNA的亞硫酸鹽變性及DNA提取

按照全細胞亞硫酸鹽DNA甲基化修飾試劑盒（Epigentek）的操作說明，取20 μL的樣品進行DNA的亞硫酸鹽變性及提取，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計

以PWS/AS基因簇的ICR區(qū)為主要的分析對象，根據(jù)NCBI上公布的牛SNRPN基因序列（GenBank ID：NM_001079797）查找其啟動子序列，使用methyl primer express software v1.0引物設計軟件分別在兩個基因的啟動子內選取一個CPG島設計引物，用于BSP測序。引物設計情況見圖1。

圖1 PCR擴增片段在SNRPN基因啟動子區(qū)的相對位置示意圖及引物設計

1.4 目標片段的擴增

參照天根生化科技（北京）有限公司MasterMix PCR試劑盒的使用說明，在2×25 μL及應體系中進行PCR反應，條件如下：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，53.6℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，38 個循環(huán)；72℃末端擴增10 min。

1.5 目標片段的克隆

用干凈的手術刀割下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入1.5 mL離心管中。采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生物工程技術服務有限公司），按照說明書操作進行膠回收。回收的DNA通過pMD19-T載體（大連寶生物公司）進行連接，連接產(chǎn)物均勻加入到30 μL的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30 min；42℃水浴熱激45 s，然后立即冰上放置冰浴1 min；每管中加入900 μL的LB肉湯培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2 h，使細菌復蘇，并表達對抗生素的抗性；然后涂布于含Amp的LB瓊脂平板中，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.6 菌落PCR鑒定

挑選平板上的單個菌落，接種于含Amp的LB肉湯中培養(yǎng)過夜，用菌液作PCR模板進行菌落PCR鑒定。從SCNT和IVF胚胎5個發(fā)育階段菌落樣本中各挑選12～15個陽性克隆，送上海英俊公司進行序列測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用BIQ甲基化分析軟件對重亞硫酸鹽測序結果分析，并對CpG位點的甲基化狀態(tài)進行統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)以x±S表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，相同階段不同類型胚胎、相同胚胎不同階段的甲基化水平和甲基化位點比較采用兩因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 目標基因擴增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在250 bp至500 bp之間接近250 bp處出現(xiàn)目的條帶，與目的片段的長度相符，見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測結果

2.2 SNRPN基因啟動子總體甲基化值測定

各個發(fā)育階段的IVF胚胎和SCNT胚胎中，SNRPN基因啟動子的甲基化測序結果見表1。

由表1可知，SCNT胚胎發(fā)育時期PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平的變化模式為：S期甲基化水平顯著低于其他各時期（P＜0.05），且其他4個時期的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；IVF胚胎發(fā)育時期PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平的變化模式為：2-cell期甲基化水平顯著低于其他各時期（P＜0.05），且其他4個時期的甲基化水平差異也均不顯著（P＞0.05）。SCNT胚胎發(fā)育至2-cell期時，PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平顯著高于IVF胚胎（P＜0.05）。

表1 PWS-IC亞區(qū)ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育期中的甲基化值

2.3 SNRPN啟動子區(qū)5個位點甲基化情況分析

如圖3所示，SNRPN轉錄起始點1 693 bp開始的258 bp序列中共檢測到5個甲基化位點。

圖3 SNRPN基因啟動子的5個甲基化位點分布

圖4 SCNT和IVF胚胎各發(fā)育時期5個位點甲基化水平

由圖4-1可見，配子期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點1的甲基化水平顯著低于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個位點的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-2可見，S期SCNT胚胎和IVF胚胎的PWS/AS亞區(qū)ICR中5個位點甲基化水平差異均不顯著（P ＞0.05）；由圖 4-3可見，2-cell期 SCNT胚胎 PWS/AS亞區(qū)ICR中位點1和位點5的甲基化水平均顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他3個位點的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-4可見，8-cell期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點1的甲基化水平顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個位點的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-5可見，囊胚期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點1的甲基化水平顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個位點的甲基化水平差異也均不顯著（（P＞0.05）。因此，位點1和位點5為去甲基化抑制機制的易感位點。

3 討論

PWS/AS基因簇的ICR區(qū)表現(xiàn)為母源印記狀態(tài)，因此，其ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育過程中的甲基化變化模式可以反映母源染色體的甲基化模式［11］。該ICR印記區(qū)在IVF胚胎中的甲基化模式為2-cell期之前進行去甲基化，并于8-cell期開始DNA甲基化的重建。該結果與前面的免疫熒光結果相吻合，與Fatima等［3］的試驗結果吻合［3］。IVF 胚胎中 PWS/AS基因簇的 ICR 區(qū)（PWS-IC）在S期前去甲基化并不顯著（P＞0.05），發(fā)育到S期，DNA大量復制后才進行了顯著的去甲基化（P＜0.05）。該檢測結果表明，母源基因的印記區(qū)段在S期之前先進行微弱的主動去甲基化，在S期DNA大量復制時進行大規(guī)模的被動去甲基化。該結論可以支持Chan、Goll和Morgan等的觀點［12］，但還有待更多的試驗驗證。

SCNT胚胎PWS/AS基因簇的ICR區(qū)（PWS-IC）甲基化模式較IVF胚胎變化比較劇烈，在卵裂之前的SCNT胚胎中PWS/AS基因簇的ICR區(qū)的甲基化水平較IVF胚胎差異不顯著（P＞0.05），見表1。卵裂后SCNT的甲基化水平發(fā)生了極顯著的升高，表明母源DNA在S期至2-cell期的發(fā)育階段進行了異常的甲基化重建，該結果證明了Dean等［13］的觀點，克隆胚胎甲基化過高的原因為過早地進行了甲基化的重建。同時也提示在去核的卵母細胞中存在著大量過表達或功能得到增強的甲基化重建相關酶，影響基因組的正常去甲基化。超甲基化水平必定會影響ICR區(qū)對于整個基因簇的調控情況，從而對細胞分化、增殖、胚胎發(fā)育等產(chǎn)生重要關系［14］。McAllister等［15］研究已經(jīng)證實，SNRPN 基因印記的紊亂還會導致神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常。

4 結論

PWS-IC區(qū)域甲基化模式改變，導致了SCNT胚胎母源DNA的高甲基化；同時篩選出了2個去甲基化抑制機制的易感位點，即SNRPN啟動子的1 693 bp開始的258 bp序列中的1號和5號位點。推測是母源DNA過早地進行了甲基化的重建，造成了克隆胚胎的甲基化過高，建議在核移植過程中優(yōu)化卵母細胞的篩選機制和卵母細胞成熟機制。

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