TPT對(duì)HL—60細(xì)胞增殖凋亡及其對(duì)核干細(xì)胞因子表達(dá)的影響

王景 張靜 王晉

摘 要：目的： 拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞增殖凋亡及其對(duì)核干細(xì)胞因子表達(dá)的影響；方法： 運(yùn)用流式細(xì)胞儀（FCM）技術(shù)—Annexin V FITC分析法，計(jì)算出藥物作用前后的細(xì)胞凋亡率。并通過(guò)運(yùn)用原位酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用western boltting等方法檢測(cè)NS基因及蛋白在HL-60白血病細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)果：0.4?mol/L的TPT作用36h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率是（16.48±2.17）%，與對(duì)照組（0.12±0.04） %相比，具有顯著性差異（P<0.05 ）；western blotting結(jié)果示，0.4?mol/LTPT作用于HL-60細(xì)胞36小時(shí)后，NS的表達(dá)水平較對(duì)照組有所下調(diào)。結(jié)論： 拓?fù)涮婵凳拱籽L-60細(xì)胞發(fā)生凋亡；NS在白血病細(xì)胞系HL-60中表達(dá)。

關(guān)鍵詞：拓?fù)涮婵?核干細(xì)胞因子 影響

中圖分類號(hào)：R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）05-0-02

拓?fù)涮婵担╰opotecan，TPT）以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）為作用靶點(diǎn)的半合成喜樹(shù)堿（CPT）衍生物，是一種新藥，呈水溶性，目前已廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療及試用于惡性血液系統(tǒng)疾病的治療[1]，并取得較好療效。研究發(fā)現(xiàn)拓?fù)涮婵稻褪且环NTopoⅠ抑制劑，作用位點(diǎn)比較獨(dú)特，拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種細(xì)胞核內(nèi)酶，無(wú)多藥耐藥現(xiàn)象，有較好的選擇性特點(diǎn)。

核干細(xì)胞因子（NS）基因[2]是一個(gè)新基因，與增殖調(diào)控功能相關(guān)，在干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中常見(jiàn)，是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白， 存在于細(xì)胞核內(nèi)，以三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）依賴的形式游動(dòng)，主要作用是和細(xì)胞增殖相關(guān)。近年來(lái)岳保紅[3]等人發(fā)現(xiàn)在早期多潛能狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞內(nèi)核干細(xì)胞因子蛋白表達(dá)量大，如果細(xì)胞開(kāi)始分化NS蛋白會(huì)表達(dá)量劇降且會(huì)很快不見(jiàn)。他們還發(fā)現(xiàn)NS蛋白參與細(xì)胞增值調(diào)控過(guò)程，提出了NS蛋白參與多種干細(xì)胞或者癌細(xì)胞自身不斷更新的進(jìn)度，并且使細(xì)胞停留在分化狀態(tài)不再繼續(xù)分化。

一、材料與方法

1.材料

1.1細(xì)胞株

人源性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞，由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2試劑

TPT（注射用鹽酸拓?fù)涮婵担?/p>

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，，正常情況下細(xì)胞生長(zhǎng)懸浮成團(tuán)，大小較均一，光滑圓潤(rùn)，細(xì)胞膜完整，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，取2X106的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡

（1）收集藥物作用組和對(duì)照組的細(xì)胞，離心，離心后按照Annexin V-FITC Kit說(shuō)明書上面的步驟，分別對(duì)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理，處理后細(xì)胞收集一起離心。

（2）洗滌細(xì)胞：用4℃的PBS對(duì)細(xì)胞洗滌2次，再用緩沖液加去離子水配成1：4的結(jié)合緩沖液稀釋洗滌后的細(xì)胞。

（3）取稀釋的結(jié)合緩沖液250?l重新使細(xì)胞得到懸浮，并調(diào)整其終濃度為1×106/ml。

（4）取上述處理好的細(xì)胞懸液100?l于流式細(xì)胞管中，依次加入5?l Annexin V/FITC和碘化丙錠溶液10?l，碘化丙啶濃度為20?g/ml。

（5）將上述混液振蕩搖勻，然后室溫下避光放置15min。

（6）在反應(yīng)管中加入400?l PBS，檢測(cè)。

（7）所獲得數(shù)據(jù)均經(jīng)Cellquest 1.2軟件詳細(xì)分析。

2.3凋亡的原位酶標(biāo)記檢測(cè)

（1）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和細(xì)胞的通透：先進(jìn)行細(xì)胞涂片處理，處理好的細(xì)胞涂片用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3 次，小心沖洗，防止沖洗過(guò)程中細(xì)胞丟失。與阻斷劑（0.3% H2O2甲醇溶液）室溫放置30min。再用PBS沖洗3次，沖洗后與通透液一起在冰浴中冰浴2min。

（2）取出EP管，PBS再次沖洗2次，保持樣品周圍干燥，滴加20?l TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃溫育60min。PBS沖洗3次。

（3）保持樣品周圍干燥，加入轉(zhuǎn)化劑-POD 30-40?l，放置濕盒中溫度為37℃下溫浴30min。

（4）取出EP管，再用PBS沖洗3次，向管內(nèi)加入50-100?l DAB底物溶液，顯微鏡下仔細(xì)觀察以控制顯色反應(yīng)時(shí)間。

（5）PBS沖洗3次，進(jìn)行脫水透明處理，并用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

（6）設(shè)立對(duì)照組：對(duì)照組：已經(jīng)固定和通透的細(xì)胞樣品中加入50?l標(biāo)記溶液，以代替TUNEL反應(yīng)混合物，其余步驟同上。

（7）TUNEL檢測(cè)的結(jié)果判定：以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為陽(yáng)性。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，以出現(xiàn)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量所占的比值作為TUNEL檢測(cè)的陽(yáng)性率結(jié)果，其計(jì)算方法如下：

TUNEL陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/300×100%。對(duì)照組也用同樣的計(jì)算方法計(jì)算。

2.4 Western blotting 檢測(cè)NS蛋白

2.4.1取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞5×106～1×107個(gè)/ml，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS進(jìn)行洗滌兩遍。

2.4.2向每瓶細(xì)胞加4℃預(yù)冷的PBS 3ml。平放并輕輕搖動(dòng)1min，然后離心，棄去PBS緩沖液和培養(yǎng)液。并重復(fù)上述操作步驟兩次，目的是能徹底的洗去培養(yǎng)液。然后將洗好的培養(yǎng)瓶放于冰上保持低溫。

2.4.3 SDS-PAGE電泳

（一）清洗玻璃板，使其表面潔凈透亮。

（二） 灌膠、上樣

1、將清洗后的兩個(gè)玻璃板對(duì)齊后放入夾中，夾緊，遂垂直卡在兩側(cè)的架子上以備灌膠。

2、室溫下配制10%分離膠，在配置好的分離膠中加入TEMED，立即搖勻，搖勻后立即灌膠，不能久放，以免膠凝固。

3、灌膠后判斷分離膠凝固的標(biāo)準(zhǔn)是肉眼能看到水和膠之間有一條折射線形成。凝固后應(yīng)再等待3min使其凝固充分，傾斜，棄去膠上面的上層液體，角落處可用吸水紙把水吸干。

4、再配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的濃縮膠，同分離膠的配置一樣，加入TEMED后立即搖勻，搖勻后可灌膠。沿角落傾斜把濃縮膠倒入玻璃板之間灌滿剩余部分，灌好后可把梳子插入濃縮膠中。此步驟應(yīng)注意灌膠時(shí)膠中有氣泡產(chǎn)生，因此使膠沿玻璃板流下可避免此種現(xiàn)象。插梳子應(yīng)注意，梳子應(yīng)水平插入，不可左傾或是右傾。濃縮膠充分凝固后，用兩手捏住梳子的兩頭垂直向上用力輕輕拔出，若膠凝固不充分，拔出梳子時(shí)可把凝固膠損壞。

5、沖洗濃縮膠，使梳子孔圓潤(rùn)光滑，然后放入電泳槽中，電泳槽內(nèi)加足夠的電泳液，要淹沒(méi)濃縮膠，至少漫過(guò)內(nèi)側(cè)的小玻璃板。

6、將提取好的組織蛋白放入潔凈的EP管內(nèi)，向其中加5×SDS 上樣緩沖液，稀釋緩沖液使其終濃度為1×SDS。將此EP管放在水浴鍋內(nèi)，沸水煮5-10min，目的是使蛋白變性。

7、準(zhǔn)備上樣。用微量槍貼壁吸取EP管內(nèi)樣品，將槍頭插至加樣孔內(nèi)并緩慢加入樣品。

2.4.4電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉、顯色；顯影、定影

2.5凝膠圖象分析

由上述步驟得到的膠片在掃描儀上掃描或用照相機(jī)進(jìn)行拍照，并用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析膜上的目的蛋白的分子量和凈光密度值。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)

由上述實(shí)驗(yàn)所得的全部數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式來(lái)表示。以α=0.05作為有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷水準(zhǔn)。

二、結(jié)果

1.流式細(xì)胞儀對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果

0.4?mol/L TPT作用HL-60細(xì)胞36h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定HL-60細(xì)胞凋亡率（以三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示）， 藥物組可明顯引起細(xì)胞凋亡，凋亡率為（16.48±2.17）%，與對(duì)照組比較（0.12±0.04）%，具有顯著性差異（P<0.01）（如表2和圖4，5）.

2.Western blotting 結(jié)果示

0.4?mol/L的TPT作用HL-60細(xì)胞36小時(shí)后，NS蛋白在白血病HL-60細(xì)胞中表達(dá)量減少，與對(duì)照組相比，條帶染色變細(xì)、變淺、變淡；經(jīng)灰度分析，對(duì)照組的平均灰度為97%，藥物組平均灰度為54%。說(shuō)明通過(guò)拓?fù)涮婵底饔煤蟮腍L-60細(xì)胞中在一定程度上抑制了NS蛋白的表達(dá)，使NS蛋白表達(dá)下調(diào)

三、討論

拓?fù)涮婵凳?996年在美國(guó)上市的半合成抗腫瘤新藥，在臨床上已開(kāi)始使用，這種藥物由Smithkline Beecham制藥公司制造，供應(yīng)于各地，它也是世界上第一個(gè)以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ為靶酶的抗腫瘤藥物，也有國(guó)產(chǎn)的拓?fù)涮婵担瑑r(jià)格也較進(jìn)口便宜，但療效較進(jìn)口為差。

本研究結(jié)果顯示：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting結(jié)果顯示對(duì)照組（未用TPT作用組）經(jīng)過(guò)0.4?mol/L TPT作用HL-60細(xì)胞36h后NS蛋白條帶明顯變淺變細(xì)，RT-PCR結(jié)果顯示NS基因表達(dá)量較對(duì)照組下降，這些結(jié)果都表明TPT可以抑制白血病細(xì)胞中NS基因的表達(dá)，使之下調(diào)，推理之TPT通過(guò)抑制NS蛋白成為治療白血病的機(jī)制之一也不為不可能。也有研究表明[4]，NS可能在細(xì)胞周期中干細(xì)胞和癌細(xì)胞穿越G2/M調(diào)控點(diǎn)的決定方面是一個(gè)特異性因子，由于它僅表達(dá)于干細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中，而白血病既是干細(xì)胞疾病又是惡性腫瘤，因此在白血病細(xì)胞中研究NS基因和NS蛋白也比較合適，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制劑，具有廣譜抗腫瘤作用，其作用機(jī)制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通過(guò)下調(diào)NS基因而達(dá)到抗白血病作用可能為其作用機(jī)制之一。

TPT可以通過(guò)抑制HL-60細(xì)胞中NS蛋白的表達(dá)，并且也可能是通過(guò)抑制NS基因的表達(dá)，使NS基因表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞離開(kāi)細(xì)胞增殖周期而不斷發(fā)生分化，使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到抗腫瘤作用。

參考文獻(xiàn)

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