拓?fù)涮婵祵?duì)核干細(xì)胞因子表達(dá)的影響

蔡弘揚(yáng) 王晉

摘 要：目的： 拓?fù)涮婵祵?duì)核干細(xì)胞因子表達(dá)的影響；方法： 采用免疫組化方法檢測(cè)NS基因及蛋白在HL-60白血病細(xì)胞中表達(dá)的影響；結(jié)果：免疫組化方法檢測(cè)NS在白血病細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)率高。結(jié)論： NS在白血病細(xì)胞系HL-60中表達(dá)。

關(guān)鍵詞：拓?fù)涮婵?核干細(xì)胞因子 影響

中圖分類號(hào)： R-0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）05-0-01

拓?fù)涮婵担╰opotecan，TPT）以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）為作用靶點(diǎn)的半合成喜樹堿（CPT）衍生物，是一種新藥，呈水溶性，目前已廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療及試用于惡性血液系統(tǒng)疾病的治療[1]，并取得較好療效。研究發(fā)現(xiàn)拓?fù)涮婵稻褪且环NTopoⅠ抑制劑，作用位點(diǎn)比較獨(dú)特，拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種細(xì)胞核內(nèi)酶，無多藥耐藥現(xiàn)象，有較好的選擇性特點(diǎn)。

核干細(xì)胞因子（NS）基因[2]是一個(gè)新基因，與增殖調(diào)控功能相關(guān)，在干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中常見，是一種鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白， 存在于細(xì)胞核內(nèi)，以三磷酸鳥苷（GTP）依賴的形式游動(dòng)，主要作用是和細(xì)胞增殖相關(guān)。近年來岳保紅[3]等人發(fā)現(xiàn)在早期多潛能狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞內(nèi)核干細(xì)胞因子蛋白表達(dá)量大，如果細(xì)胞開始分化NS蛋白會(huì)表達(dá)量劇降且會(huì)很快不見。他們還發(fā)現(xiàn)NS蛋白參與細(xì)胞增值調(diào)控過程，提出了NS蛋白參與多種干細(xì)胞或者癌細(xì)胞自身不斷更新的進(jìn)度，并且使細(xì)胞停留在分化狀態(tài)不再繼續(xù)分化。

一、材料與方法

1.材料

1.1細(xì)胞株

人源性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞，由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2試劑

TPT（注射用鹽酸拓?fù)涮婵担?/p>

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，，正常情況下細(xì)胞生長(zhǎng)懸浮成團(tuán)，大小較均一，光滑圓潤(rùn)，細(xì)胞膜完整，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，取2X106的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

根據(jù)免疫組化的實(shí)驗(yàn)說明。

2.2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞爬片：將新的蓋玻片（8*8mm）用酒精棉球擦洗凈，泡酸，75%的酒精溶液中浸泡30分鐘，然后取出用雙蒸水洗滌幾次，烘箱烘干，再用多聚賴氨酸（黏合劑）涂片，烤箱烘干，紫外消毒30分鐘。消毒好的蓋玻片放在90mm的培養(yǎng)皿中，并在次培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，細(xì)胞密度一般為2*104/ml，接種好后開始進(jìn)行細(xì)胞爬片，放置在含量為5%的CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過2-3天后即可進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色鑒定。

取出培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片后，PBS洗3次，每次5min，得到細(xì)胞涂片。

將細(xì)胞涂片放置在4%多聚甲醛內(nèi)固定30分鐘，到時(shí)間后，用蒸餾水進(jìn)行沖洗，然后放置在含3%H2O2的去離子水中，室溫下浸泡10分鐘，目的是滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以免影響后續(xù)試驗(yàn)。

試劑盒內(nèi)取出封閉用正常山羊血清（試劑A），擠出1滴A于表面，放置室溫條件下20分鐘，然后輕輕甩去玻片表面多余液體。在載玻片表面滴加第一抗體（羊抗NS），放置4℃冰箱，過夜。

過夜后，取出，用PBS緩沖液沖洗，一般沖洗3次，每次沖洗5分鐘。取出試劑盒內(nèi)第二抗體SP-9000，試劑B，此步驟即滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，然后放置室溫下，10-15分鐘。

再用PBS緩沖液沖洗，共3次，每次5分鐘。試劑盒內(nèi)取出（試劑C），也即滴加1滴辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素溶液，放置于室溫下，時(shí)間為10-15分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加2滴DAB溶液（DAB溶液需要新鮮配制現(xiàn)配現(xiàn)用，放置太久失效），放在顯微鏡下觀察，并控制顯色時(shí)間。顯色好后用流動(dòng)的自來水沖洗載玻片，沖洗后顯色反應(yīng)終止。經(jīng)過蘇木素復(fù)染，在經(jīng)過脫水﹑透明，然后封片。放置光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

2.2.2 陽(yáng)性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃至棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。并在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，以染色陽(yáng)性的細(xì)胞所占的百分比值作為NS蛋白免疫組化檢測(cè)的結(jié)果。并對(duì)NS蛋白表達(dá)陽(yáng)性所占比例進(jìn)行下列計(jì)算：

陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)=細(xì)胞陽(yáng)性染色個(gè)數(shù)/300×100%。

采用文獻(xiàn)報(bào)道的常用方法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色深度計(jì)分乘積即表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。

癌細(xì)胞免疫組化染色著色深淺計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無色，l分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。

表達(dá)強(qiáng)度=染色深淺×陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。≤1分的判定為表達(dá)陰性，>1判定為表達(dá)陽(yáng)性。

二、結(jié)果

免疫組化結(jié)果示TPT對(duì) HL-60細(xì)胞NS蛋白表達(dá)的影響：

HL-60細(xì)胞內(nèi)加入0.4?mol/L的拓?fù)涮婵?，?jīng)過36小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行免疫組化，檢測(cè)到核干細(xì)胞因子蛋白在細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比為5.67%，而對(duì)照組中不加拓?fù)涮婵档募?xì)胞內(nèi)核干細(xì)胞因子蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞百分比例已達(dá)到89.67%，顯然，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義性（P<0.05）。（表1）。

三、討論

拓?fù)涮婵凳?996年在美國(guó)上市的半合成抗腫瘤新藥，在臨床上已開始使用，這種藥物由Smithkline Beecham制藥公司制造，供應(yīng)于各地，它也是世界上第一個(gè)以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ為靶酶的抗腫瘤藥物，也有國(guó)產(chǎn)的拓?fù)涮婵担瑑r(jià)格也較進(jìn)口便宜，但療效較進(jìn)口為差。

急性白血病 （acute leukemia） [4]是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，特點(diǎn)是造血干細(xì)胞功能大部分喪失，細(xì)胞不斷增殖克隆，白血病患者的造血干細(xì)胞和正常的造血干細(xì)胞存在類似的特點(diǎn)。白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率越來越高，死亡率也很高，這就嚴(yán)重影響了國(guó)民健康。但是隨著聯(lián)合化療的不斷發(fā)展[5]，骨髓移植術(shù)的不斷提高，免疫治療及基因治療的不斷改善[5]，急性白血病的治療效果明顯得到了很大的提高。有研究報(bào)道核干細(xì)胞因子在正常造血系統(tǒng)的造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在成熟細(xì)胞和淋巴細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)它的蹤跡；白血病細(xì)胞是些不分化的幼稚細(xì)胞，無限增殖克隆[6]，因此，NS在白血病細(xì)胞可發(fā)現(xiàn)，但目相關(guān)關(guān)NS在白血病細(xì)胞表達(dá)的研究不多甚至少有[7]。拓?fù)涮婵的芊褚砸种芅S蛋白在白血病細(xì)胞中表達(dá)的方式，來阻止白血病細(xì)胞的無限克隆增殖還需進(jìn)一步研究，TPT對(duì)白血病細(xì)胞的抗腫瘤作用與NS基因的表達(dá)之間是否存在相關(guān)的關(guān)系有待進(jìn)一步探索。本研究應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)探討TPT對(duì)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用，并檢測(cè)TPT是否能夠抑制白血病細(xì)胞中的核干細(xì)胞因子及其蛋白的表達(dá)使其下調(diào)，從而更深層次的明確TPT治療白血病細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。

本研究結(jié)果顯示：通過免疫組化結(jié)果顯示對(duì)照組（未用TPT作用組）可見核內(nèi)棕黃色著色深度深，而經(jīng)過0.4?mol/L TPT作用36小時(shí)后的HL-60細(xì)胞著色深度明顯變淺甚至沒有著色，結(jié)果都表明TPT可以抑制白血病細(xì)胞中NS基因的表達(dá)，使之下調(diào)，推理之TPT通過抑制NS蛋白成為治療白血病的機(jī)制之一也不為不可能。也有研究表明，NS可能在細(xì)胞周期中干細(xì)胞和癌細(xì)胞穿越G2/M調(diào)控點(diǎn)的決定方面是一個(gè)特異性因子，由于它僅表達(dá)于干細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中，而白血病既是干細(xì)胞疾病又是惡性腫瘤，因此在白血病細(xì)胞中研究NS基因和NS蛋白也比較合適，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制劑，具有廣譜抗腫瘤作用，其作用機(jī)制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通過下調(diào)NS基因而達(dá)到抗白血病作用可能為其作用機(jī)制之一。

TPT可以通過抑制HL-60細(xì)胞中NS蛋白的表達(dá)，并且也可能是通過抑制NS基因的表達(dá)，使NS基因表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞離開細(xì)胞增殖周期而不斷發(fā)生分化，使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到抗腫瘤作用。

參考文獻(xiàn)

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