長(zhǎng)壽老人源降膽固醇乳酸菌的分離鑒定及生化特性研究

玉力吐孜·迪力木臘提 努爾哈提·斯拉甫爾 烏斯?jié)M·依米提

摘 要：【目的】分離純化新疆喀什維吾爾族長(zhǎng)壽老人腸道中的降膽固醇乳酸菌及其生物學(xué)特性研究?！痉椒ā客ㄟ^(guò)平板分離法從喀什維吾爾族長(zhǎng)壽老人腸道中共分離獲得降膽固醇候選菌株10株，并采用硫酸鐵銨法測(cè)定菌株對(duì)選擇性培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率，并進(jìn)行了16SrDNA測(cè)序和分子鑒定。 【結(jié)果】篩選出的10株實(shí)驗(yàn)菌株均能從培養(yǎng)基中除去膽固醇，去除率都大于60%，經(jīng)過(guò)分子鑒定為乳酸菌，都屬于腸球菌。其中篩選出3株調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)的候選菌（R08-37，R05-24，R02-6）。表明這些菌株對(duì)人類的長(zhǎng)壽能起到一定的作用。

關(guān)鍵詞：喀什 長(zhǎng)壽老人腸道 降膽固醇 乳酸菌

中圖分類號(hào)：Q93-31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082 （2018）05-0-02

目前，新疆南疆地區(qū)是我國(guó)正式命名的7大“長(zhǎng)壽地區(qū)”之一[1]。研究者曾經(jīng)對(duì)我國(guó)著名的長(zhǎng)壽地區(qū)進(jìn)行多次調(diào)查和研究總結(jié)出的長(zhǎng)壽因素有基因遺傳[2]、氣候條件、環(huán)境因素[3]、合理飲食結(jié)構(gòu)、居住環(huán)境[4]等等，而長(zhǎng)期忽略了人類共生微生物。近幾十年以來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明[5-7]，共生微生物也有較強(qiáng)的降膽固醇功能。

乳酸菌是人體腸道中重要的益生菌，除了在調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、提高免疫系統(tǒng)功能起著重要的作用[8]以外還具有降低食物及人體血清中膽固醇含量的作用。

本研究首次我國(guó)喀什地區(qū)90歲以上維吾爾族長(zhǎng)壽老人糞便為實(shí)驗(yàn)材料，篩選出具有降膽固醇、對(duì)膽鹽及酸有較強(qiáng)的耐受性的乳酸菌，為食品、藥品等行業(yè)提供優(yōu)良菌種。

一、材料與方法

1.材料

樣品來(lái)源：從新疆喀什地區(qū)采集16位維吾爾族人糞便樣品（男性8名，女性8名），90～102歲；所有采樣對(duì)象在被采樣前至少兩個(gè)星期內(nèi)未服用任何含有活菌的發(fā)酵食品、未服用任何種類的抗生素類藥物。

主要試劑：改良的MRS+CaCO3固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、濃度為0.1mg/mL 的高膽固醇MRS-CHOL選擇性培養(yǎng)基[9]；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶、Tag聚合酶等。

2.方法

2.1 乳酸菌的分離、純化

將長(zhǎng)壽老人糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋至10-4，10-5和10-6，在經(jīng)過(guò)滅菌并冷卻到45～50℃的改良MRS+CaCO3瓊脂培養(yǎng)基上涂布，37℃厭氧培養(yǎng)24-36h，挑取菌落比較大、有透明圈的菌落，進(jìn)行純化處理，之后置于甘油中存儲(chǔ)。

2.2 菌株形態(tài)觀察

對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色，并進(jìn)行鏡檢[10]。

2.3 體外膽固醇能力的測(cè)定

運(yùn)用硫酸鐵銨法[11]對(duì)膽固醇含量進(jìn)行測(cè)定，且繪制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

膽固醇的調(diào)節(jié)率/%=（C-A）/C╳100%

其中A指的是各實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵后的選擇培養(yǎng)液OD620nm； C指的是空白對(duì)照的OD620nm。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 菌株屬的鑒定：對(duì)篩選出的革蘭氏陽(yáng)性菌菌株實(shí)施生化特性測(cè)定，主要涉及硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、半乳糖試驗(yàn)、45℃生長(zhǎng)試驗(yàn)，pH4.5生長(zhǎng)試驗(yàn)等。

2.4.2 菌株16S rDNA序列鑒定：對(duì)菌液進(jìn)行活化處理，采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行提取。將細(xì)菌DNA作為基礎(chǔ)，采用27F（5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3）、1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）實(shí)施PCR擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，正確的擴(kuò)增子則委托生物工程（上海）股份有限公司實(shí)施DNA測(cè)序。將最終結(jié)果提交NCBI基因庫(kù)，實(shí)施Blast比對(duì)分析。

2.5 分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel（2010）進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，所有的數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，每次實(shí)驗(yàn)均做平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X ±SD）。應(yīng)用SPSS（19.0）軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)（Independent-Samples T test）、單因素方差分析（one-way ANOVA）多重比較進(jìn)行分析。P<0.05表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果與分析

1.菌株的分離、純化

通過(guò)分離獲取人源乳酸菌10株，經(jīng)革蘭氏染色表現(xiàn)為陽(yáng)性。

2.體外檢測(cè)膽固醇含量

將膽固醇質(zhì)量濃度（mg/mL）作為橫坐標(biāo)，將620nm下的吸光度值作為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，可得擬合直線方程為：y=0.5308x+0.001，該方程的R2=0.9941，存在較高的擬合度，表明此直線方程可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.人源乳酸菌調(diào)節(jié)能力測(cè)定

對(duì)從采集的8份樣品（長(zhǎng)壽組）中分離獲得的10株菌株進(jìn)行體外降膽固醇能力以及各菌株對(duì)膽固醇的去除率的測(cè)定，10株調(diào)節(jié)率≥60%的乳酸菌（表1）

由表可知，對(duì)膽固醇調(diào)節(jié)能力的測(cè)定結(jié)果顯示，菌株R08-37的調(diào)節(jié)能力最高，對(duì)應(yīng)的調(diào)節(jié)膽固醇的量為52.75ug/mL。

4.候選菌株的生化鑒定和16SrDNA測(cè)序結(jié)果

已分離的10株乳酸菌均為革蘭氏染色陽(yáng)性，吲哚實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、半乳糖試驗(yàn)等均表現(xiàn)為陰性，于15℃、45℃環(huán)境下能夠生長(zhǎng)，于60℃環(huán)境下不可生長(zhǎng)；可耐受6.5%NaCl，可于pH9.6環(huán)境下生長(zhǎng)，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，繼而判斷為腸球菌屬。

5.菌株16SrDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

從圖中可知，RO1-1HQ603859、RO1-2HQ603858、R02-6（JF896442）、R02-7（JF896442）、R04-20（DQ411813）為Enteroco durans的不同變異品系；R05-21（AF539705）、R05-22（AJ306297）、R05-23（HM443954）均為Enterococcus faecium的不同變異品系；R05-24（D16552）、R08-37（AF469172）為L(zhǎng)actobacillus plantanum的不同變異品系。

將10株候選菌株目的片段委托生物工程（上海）生物科技有限公司測(cè)序后，提交NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)結(jié)果顯示均為腸球菌。

三、討論

由表1可以得知已篩選分離純化的39株人源乳酸菌都能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的膽固醇，其中篩選出10株調(diào)節(jié)膽固醇能力高于60%的候選菌株。郭欽【12】、溫子輝【13】、彭燦【14】、呂秀紅【15】研究的食品源乳酸菌的降膽固醇率分別達(dá)到30.9%、52.2%、69%，50.03%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合常規(guī)，也具有很大的優(yōu)勢(shì)。

篩選出的乳酸菌除了具備降膽固醇功能外，還應(yīng)考慮到其他方面的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，所選取的菌株不僅要具有降膽固醇活性，而且生長(zhǎng)范圍均比較廣（15℃～45℃）、耐pH9.6、耐鹽（6.5%），有較強(qiáng)的腸道膽鹽環(huán)境耐受性，具有菌株特異性。

綜上所述，乳酸菌的去除膽固醇能力、低pH的耐受性并無(wú)明顯相關(guān)性，菌株之間存在差異性。在本研究中，所篩選出的三株菌株具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值，繼而為乳酸菌和長(zhǎng)壽的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：玉力吐孜·迪力木臘提（1990.2.1-），女，維吾爾族，碩士，研究方向：微生物資源開發(fā)。

通訊作者：烏斯?jié)M·依米提，男，維吾爾族，副教授，博士，研究方向：微生物資源與開發(fā)。