分子印跡固相萃取光譜法快速檢測豬肉中左氧氟沙星

張圓 李龍 蘇立強 初洪濤 孫琳 覃瀟 杜一平

摘 要 以表面接枝乙烯基的硅膠為載體，左氧氟沙星為模板分子，合成了選擇性識別左氧氟沙星的印跡聚合物。使用元素分析、紅外光譜對制備的聚合物進行表征，通過動態(tài)吸附及選擇性吸附進行性能測定。結(jié)果表明，此印跡聚合物最大吸附量達56.33 mg/g，印跡因子為2.62。將所合成的硅膠表面左氧氟沙星分子印跡聚合物用于實驗室自主開發(fā)的分子印跡固相萃取漫反射光譜檢測裝置，對左氧氟沙星進行定量分析。樣品經(jīng)此裝置固相萃取后，不經(jīng)洗脫，直接對固相萃取介質(zhì)進行漫反射光譜測定，簡化了操作過程，提高了靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=0.0496C+0.2412，線性范圍為0.25～9.0 mg/L， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，檢出限為0.24 mg/L。豬肉樣品中的加標(biāo)回收率為89.1%～92.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.4%～7.9%（n=3）。相比于傳統(tǒng)的富集分離技術(shù)，本方法具有裝置小型化和集成化、靈敏度和選擇性高、成本低、簡單快速等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞 分子印跡； 左氧氟沙星； 固相萃取； 漫反射光譜

1 引 言

分子印跡聚合物是一種基于模板分子和功能單體之間相互作用的選擇性富集材料。傳統(tǒng)的合成分子印跡的方法主要有本體聚合法、原位聚合法和沉淀聚合法[1]。但傳統(tǒng)方法存在模板分子洗脫不完全、識別位點結(jié)合效率低、傳質(zhì)速率慢等缺點[2]。相比于其它方法，表面印跡制備技術(shù)在支撐材料的表面構(gòu)建分子識別系統(tǒng)[3～7]。由于其識別位點位于材料表面，使得模板分子更易與識別位點結(jié)合，可快速達到飽和吸附，因此具有良好的熱穩(wěn)定性、較高的結(jié)合速率以及較大的吸附容量[8～10]。目前常用的支撐印跡材料主要有硅膠納米微球[11，12]、硅膠納米管[13]及磁性納米微球等[14]。

膜富集-在線漫反射光譜檢測技術(shù)，又稱膜固相萃取光譜技術(shù)，在被測組分富集后不經(jīng)洗脫而在固相材料上直接測定固相光譜，方法簡單、快速、靈敏，選擇性較好[15]。Wang 等[16]將膜固相萃取技術(shù)與紫外可見光譜結(jié)合，利用金屬離子與絡(luò)合劑反應(yīng)生成有色疏水絡(luò)合物，然后將有色絡(luò)合物富集到濾膜上，無需洗脫，直接對濾膜上的物質(zhì)進行檢測。Li 等[17]對常規(guī)的膜富集過程進行改進，構(gòu)建了一種多通道膜富集裝置測定飲料和河水樣品中羅丹明B的濃度，利用多通道富集裝置，將多個樣品富集在同一張膜上，最大限度減小實驗中所用膜的差異性。Wei 等[18]提出了一種快速、簡單、靈敏的膜富集固相萃取結(jié)合漫反射光譜定量檢測光氣的方法，操作簡單，背景干擾少。

在膜固相萃取光譜技術(shù)基礎(chǔ)上，本研究選用分子印跡作為富集材料，發(fā)展了一種分子印跡固相萃取-在線漫反射檢測技術(shù)，進一步提高了檢測目標(biāo)分子的選擇性。以表面接枝乙烯基的硅膠為載體，合成了左氧氟沙星印跡聚合物，并將此聚合物應(yīng)用于分子印跡固相萃取光譜技術(shù)中，實現(xiàn)了豬肉中抗生素左氧氟沙星[19]的快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Evolution 220紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）； SHB三循環(huán)泵真空泵（上海衛(wèi)鎧水儀器設(shè)備有限公司）； 超聲波清洗器（上海聲彥超聲儀器有限公司）； DZF-6020真空干燥箱（上海予英儀器有限公司）； 實驗用水為超純水（≥18.2 MΩ·cm，SARTORIUS arium611DI，Germany）。

HCl、甲醇（永華科技（江蘇）有限公司）； 硅膠（200～300目，上海盛亞化工有限公司）； 甲苯、丙酮（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 甲基丙烯酸（MAA， 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）； 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA， 日本東京化成工業(yè)株式會社）； 偶氮二異丁腈（AIBN）、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、乙酸（上海晶純生化科技股份有限公司）。

2.2 硅膠活化與硅烷化

稱取硅膠10 g于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL 10% HCl， 110℃攪拌12 h，用超純水洗至中性，在120℃下真空干燥12 h，以增加硅膠表面的羥基數(shù)目，并除去硅膠表面的雜質(zhì)。

稱取活化好的硅膠，加入100 mL甲苯、 10 mL KH-570，在氮氣保護下110℃回流12 h，產(chǎn)物依次用甲苯、甲醇、丙酮洗滌過濾，在60℃條件下真空干燥過夜，得到表面硅烷化偶聯(lián)劑的硅膠[6]。

2.3 左氧氟沙星分子印跡聚合物（MIP）的制備

稱取模板分子0.1852 g（0.5 mmol）和功能單體MAA 0.1812 g（2 mmol）溶于50 mL甲醇-甲苯（9∶1， V/V）混合溶劑中，超聲30 min，靜置過夜。加入1 g硅烷化硅膠、交聯(lián)劑EDMA 10 mmol（2.0435 g）、引發(fā)劑AIBN 30 mg，反復(fù)充氮排氧后密封，60℃保溫并在磁力攪拌下反應(yīng)24 h，將產(chǎn)物過濾，并用甲醇洗滌。用甲醇-乙酸（9∶1， V/V）索氏提取，除去模板分子，直至提取液中未檢測到左氧氟沙星的信號為止（采用紫外可見分光光度法檢測左氧氟沙星）。將得到的MIP用丙酮沉降以及甲醇洗滌后，過濾，60℃條件下真空干燥12 h，獲得左氧氟沙星MIP。合成非分子印跡（NIP）的過程與MIP過程相同，只是不加模板分子。

2.4 聚合物的表征

2.4.1 吸附動力學(xué)曲線的測定 準(zhǔn)確稱取MIP 20 mg至10 mL左氧氟沙星溶液的離心管中，室溫下分別振蕩5、10、20、40、80和100 min，離心，取上清液，用紫外可見分光光度計測量上清液的濃度。按照公式（1）計算吸附量Q（mg/g）

Q=（C0-Cx）V/m（1）

其中，C0為吸附前左氧氟沙星的初始濃度（mg/L）； Cx為吸附后左氧氟沙星的平衡濃度（mg/L）； V為溶液的體積（mL）； m為聚合物質(zhì)量（g）。

2.4.2 吸附等溫線的測定 準(zhǔn)確稱取20 mg MIP至裝有10 mL左氧氟沙星溶液的離心管中，室溫下振蕩10 min，離心，取上清液，用紫外可見分光光度計測定吸附后上清液的濃度。NIP重復(fù)上述步驟。根據(jù)吸附前后溶液中左氧氟沙星的濃度計算MIP及NIP的吸附量。印跡因子是評價分子印跡特異性的重要參數(shù)，按照公式（2）計算：

α=QMIP/QNIP（2）

其中α為印跡因子； QMIP為MIP平衡時的吸附量（mg/g）； QNIP為NIP平衡時的吸附量（mg/g）。

2.4.3 吸附選擇性的測定 準(zhǔn)確稱取20 mg MIP，分別加入10 mL 100 mg/L的左氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下振蕩4 h，離心，測上清液濃度。同樣處理NIP。根據(jù)公式（1）計算各自吸附量。用分配系數(shù)KD、選擇性系數(shù) k和相對選擇性系數(shù)k'考察聚合物的吸附特異性：

KD = Qe/Ce，k=KD氧氟沙星/KDi， k' = kMIP/kNIP

其中，Qe（mg/g） 為平衡吸附量，Ce（mg/mL） 為吸附平衡時上清液中左氧氟沙星等的濃度，KD和KDi 分別為氧氟沙星和競爭分子的分配系數(shù)，kMIP和kNIP分別為MIP和NIP的選擇性系數(shù)。

2.5 豬肉樣品的提取與凈化

豬肉樣品購于本地超市，稱取10 g于50 mL燒杯中，加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=7）作為提取液，超聲10 min后，3000 r/min 離心5 min，上清液移至另一燒杯中，向殘渣中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH =7），重復(fù)上述操作1次，合并上清液。LC-C18固相萃取柱依次用2.0 mL的甲醇、磷酸鹽緩沖液淋洗活化，取上清液進行上樣，用10 mL甲醇洗脫2次。收集洗脫液于50 mL離心管中， 備用。實際樣品豬肉中未檢測出左氧氟沙星，向豬肉樣品中添加2、5和9 mg/L的左氧氟沙星，測定回收率。

2.6 分子印跡固相萃取光譜的檢測

本實驗利用所制備的印跡聚合物代替膜材料，進行固相萃取光譜檢測。設(shè)計了專門的富集分離和光譜檢測裝置，如圖1所示，此裝置含有能夠截留吸附材料的富集模塊5，模塊上下有通道孔1和2，用于吸附材料的填裝和樣品溶液的流入和流出。

在真空或壓力的作用下，樣品溶液通過富集模塊5上側(cè)的孔道1流過吸附材料，進行富集和分離，濾液通過下方的孔道2流出。此裝置的上下端均用反光鋁片3、4進行封裝，側(cè)面使用鋁箔進行封裝，保證整個裝置不漏光。富集后，在富集端直接測定漫反射紫外光譜。

準(zhǔn)確稱取60 mg MIP裝填于封裝型富集分離裝置中，富集20 mL不同濃度的左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或豬肉樣品洗脫液，將裝置直接放置在紫外-可見漫反射吸收光譜儀上檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 表面印跡材料的表征

3.1.1 元素分析 活化硅膠和硅烷化硅膠的元素分析結(jié)果表明，活化硅膠表面的碳、氫元素含量均低于0.50%； 活化硅膠表面接枝KH-570后，碳、氫元素含量分別提高到9.79%和1.51%。表明硅烷化偶聯(lián)劑KH-570已成功接枝到硅膠表面。

3.1.2 紅外光譜分析 在活化硅膠的紅外光譜圖（圖2）中，1103 cm1是SiOSi的伸縮振動峰，973 cm1是SiOH的伸縮振動峰，3445和1635 cm1是OH的伸縮振動峰，表明硅膠經(jīng)過酸活化后表面富含活性的羥基。由圖2可見，羥基的相對強度明顯減弱，973 cm1 處的SiOH吸收峰消失，硅烷化后的CO的特征吸收峰在1721 cm1。表面印跡聚合物MIP的紅外譜圖中，聚合物中酯基的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰在1148 cm1[19～21]。

3.2 印跡聚合物對氧氟沙星的吸附性能

吸附動力學(xué)實驗結(jié)果表明，在0～10 min，表面印跡材料對左氧氟沙星的吸附量迅速增加，并達到平衡。吸附時間明顯快于以沉淀聚合方法制備的聚合物[23]，這是由于表面印跡方法制備的聚合物的識別位點暴露在外面，因而MIP具有很快的傳質(zhì)和吸附速度。

隨著左氧氟沙星濃度的逐漸增大，印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附量也逐漸增加（圖3），當(dāng)左氧氟沙星濃度大于800 mg/L后，印跡聚合物的吸附量已趨于平衡。說明在此濃度下，印跡聚合物對左氧氟沙星的吸附已經(jīng)達到平衡，處于飽和狀態(tài)，吸附容量為56.33 mg/g。在相同濃度下，MIP的吸附量明顯高于NIP的吸附量， 這是因為MIP中存在與左氧氟沙星空間結(jié)構(gòu)、尺寸大小、結(jié)合位點完全匹配的孔穴，這些特異性的結(jié)合位點增強了左氧氟沙星與印跡聚合物的親和性。而非印跡聚合物缺少特異性結(jié)合位點，對左氧氟沙星的吸附為非特異性的表面物理吸附，吸附容量為21.5 mg/g，吸附容量小。通過計算得出印跡聚合物的印跡因子為2.62。說明此印跡聚合物具有較高的特異性[24，25]。

3.3 印跡聚合物的選擇性能研究

在相同的初始濃度下，印跡聚合物對左氧氟沙星的吸附量遠(yuǎn)大于四環(huán)素和恩諾沙星，說明此印跡聚合物對左氧氟沙星具有良好的識別力。MIP對于四環(huán)素和恩諾沙星的選擇性系數(shù) k分別為7.82和19.49， MIP相對NIP的相對選擇性系數(shù) k'分別為1.05、1.36，以上結(jié)果說明，MIP對左氧氟沙星具有良好的吸附能力（圖4）。

3.4 印跡聚合物在固相萃取光譜檢測中的應(yīng)用

將左氧氟沙星分子印跡聚合物材料裝填在圖1的裝置中，富集不同濃度的左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，富集后直接放置在紫外-可見漫反射吸收光譜儀上檢測光譜，檢測波長為297 nm，圖5是標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。線性方程為A=0.0496C+0.2412，R2=0.9924，線性范圍為0.25～9.0 mg/L，其中C為左氧氟沙星的濃度（mg/L），A為左氧氟沙星/甲醇溶液在297 nm下的吸光度值， 檢出限為0.24 mg/L（3σ）。對豬肉樣品中左氧氟沙星進行了檢測，結(jié)果見表1。 左氧氟沙星在豬肉樣品中的加標(biāo)回收率為89.1%～92.0%，RSD為3.4%～7.9%（n=3）。國標(biāo)方法采用液相色譜-質(zhì)譜法檢測左氧氟沙星，步驟繁瑣、儀器要求高[26]，本方法簡單快速、易于操作、成本低、便于攜帶，有望應(yīng)用于大量樣品的現(xiàn)場快速篩查。

4 結(jié) 論

本研究合成了硅膠表面左氧氟沙星分子印跡聚合物，其對左氧氟沙星有較強的吸附能力，吸附量為QMIP=56.33 mg/g，在10 min內(nèi)接近飽和吸附，具有快速富集的能力。將所合成的左氧氟沙星分子印跡聚合物與固相萃取光譜技術(shù)相結(jié)合檢測左氧氟沙星，檢出限為0.24 mg/L，對豬肉樣品進行檢測，加標(biāo)回收率在89.6%～92.0%之間，RSD為3.4%～7.9%，可滿足實際分析要求。本方法簡單、快速，靈敏度高， 選擇性好，為食品中抗生素的快檢提供了一種新方法。

References

1 Wackerlig J， Schirhagl R. Anal. Chem.， 2016， 88（1）： 250-261

2 Li Q， Su H， Tan T. Biochem. Engineer. J.， 2008， 38（2）： 212-218

3 Gao B， An F， Zhu Y.Polymer， 2007， 48（8）： 2288-2297

4 Xu P， Xu W， Zhang X， Yang Y. Microchim. Acta， 2010， 171（3）： 441-449

5 ZHOU Yan-Mei， XU Wen-Guo， TONG Ai-Jun. Chinese J. Anal. Chem.， 2006， 34（11）： 1551-1554

周艷梅， 徐文國， 童愛軍. 分析化學(xué)， 2006， 34（11）： 1551-1554

6 SU Li-Qiang， LUAN Tian， GUO Xiao-Li. Chemistry， 2012， 75（10）： 908-913

蘇立強， 欒 田， 郭曉麗. 化學(xué)通報， 2012， 75（10）： 908-913

7 JI Feng， ZHAO Li-Xia， FENG Yin-Zhong， YAN Wei， LIN Jin-Ming. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（7）： 920-924

冀 峰， 趙利霞， 馮飲忠， 嚴(yán) 煒， 林金明. 分析化學(xué)， 2008， 36（7）： 920-924

8 Yang R， Zhu D， Wen H， Fu A， Zhao Z， Dai G， Miao Z， Hu Y. J. Sep. Sci.， 2017， 40（5）： 1150-1157

9 ZHAO Li-Juan， QI Yu-Xia， WEI Ling-Ling， LI Wen-Jing， LI Ya， WANG Fu-Qiang， GONG Pu-Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（10）： 1562-1567

趙麗娟， 祁玉霞， 魏玲玲， 李文婧， 李 亞， 王富強， 龔波林. 分析化學(xué)， 2016， 44（10）： 1562-1567

10 Jaroniec M， Deryo A， Marczewski A. Chemischer Informationsdienst， 1983， 114（4）： 393-397

11 LIU Qiu-Ye， LI Wen-You， HE Xi-Wen， CHEN Lang-Xing， ZHANG Yu-Kui. Acta Chimica Sinica， 2008， 66（1）： 56-62

劉秋葉， 李文友， 何錫文， 陳朗星， 張玉奎. 化學(xué)學(xué)報， 2008， 66（1）： 56-62

12 Xia Z， Lin Z， Xiao Y， Wang L， Zheng J， Yang H， Chen G. Biosens. Bioelectron.， 2013， 47（47C）： 120-126

13 Yang H H， Zhang S Q， Yang W， Chen X L， Zhuang Z X， Xu J G， Wang X R. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（13）： 4054-4055

14 Xu C， Uddin K M， Shen X， Jayawardena Hs， Yan M， Ye L.ACS Appl. Mater. Interfaces， 2013， 5（11）： 5208-5213

15 Li W， Wang H T， Jiang W， Wang L， Zhang R Q， Li H， Wu T， Du Y P.Anal. Methods， 2015， 8（1）： 129-135

16 Wang L， Cao P， Li W， Tong P J， Zhang X F， Du Y P. Spectrochim. Acta A， 2016， 159： 151-156

17 Li W， Wang L， Tong P J， Iqbal J， Zhang X F， Wang X， Du Y P.RSC Adv.， 2014， 4（94）： 52123-52129

18 Wei H， Li H， Liu P， Tao X， Fan C， Li L， Zhang R， Du Y.Spectr. Lett.， 2017， 50（9）： 470-475

19 ZENG Hua-Jin， LI Meng-Ting， LI Qing， HU Fei-Fei.Chinese Journal of Luminescence， 2016， 37（4）： 481-486

曾華金， 李夢婷， 李 晴， 胡菲菲. 發(fā)光學(xué)報， 2016， 37（4）： 481-486

20 CHEN Yan-Ting. Chemical Research and Application， 2015， 27（12）： 1875-1878

陳顏婷. 化學(xué)研究與應(yīng)用， 2015， 27（12）： 1875-1878

21 TANG Zhi-Ming， MA Xin-Bin. Chemical Industry and Engineering Progress， 2016， 35（4）： 1162-1166

唐志明， 馬新賓. 化工進展， 2016， 35（4）： 1162-1166

22 GONG Yan-Ru， WANG Yue， DONG Jia-Bin， YANG Jing， REN Xiao-Wei， GONG Bo-Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（1）： 28-35

龔艷茹， 王 玥， 董佳斌， 楊 靜， 任曉偉， 龔波林. 分析化學(xué)， 2014， 42（1）： 28-35

23 GAO Yan-Bu， ZHU Gui-Fen， FAN Jing.Chemical Research and Application， 2011， 23（8）： 980-984

高燕哺， 朱桂芬，樊 靜. 化學(xué)研究與應(yīng)用， 2011， 23（8）： 980-984

24 SU Chao， SU Li-Qiang， ZHANG Xin-Jia， WEI Dan.Chemical Industry Times， 2013， 27（1）： 1-4

蘇 超， 蘇立強， 張欣佳， 魏 丹. 化工時刊， 2013， 27（1）： 1-4

25 GAO Yuan， SU Li-Qiang， LI Ji-Jiao.Chemical Industry Times， 2015， 29（12）： 16-19

高 源， 蘇立強， 李繼姣. 化工時刊， 2015， 29（12）： 16-19

26 GB/T 21312-2007， Analysis of Fourteen Quinolones in Food of Animal Origin by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. National Standards of the People's Republic of China

動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 21312-2007