人參皂苷Re在正常和中波紫外線輻射損傷模型大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)比較研究

孫巖 肖楠 李光 韓燕燕 劉淑瑩 王恩鵬 陳長寶

摘 要 建立了超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（UPLC-QQQ-MS）檢測大鼠血漿中G-Re含量的方法，用于比較研究人參皂苷Re（Ginsenoside Re， G-Re）在正常大鼠和UVB輻射損傷模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為。選用Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm × 3.0 mm，2.7 μm），以0.1%甲酸-乙腈為流動相，梯度洗脫。電噴霧離子源（ESI）在負(fù)離子模式下，選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描，內(nèi)標(biāo)法定量，用于G-Re定量分析的離子為m/z 991.54/945.53/475.60。方法檢出限為4.0 ng/mL，定量限為13.5 ng/mL，G-Re在15～20000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r =0.999）；日內(nèi)和日間精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性均能滿足藥代動力學(xué)分析要求。結(jié)果表明，兩組大鼠分別單次口服50 mg/kg G-Re后，體內(nèi)代謝過程表現(xiàn)皆符合二室模型特征， 正常組和模型組t1/2α分別為（0.21±0.04）h和（0.69±0.07）h，t1/2β分別為（17.08±0.53）h和（21.40±16.77）h，AUC（0-t）分別為（321.91±2.27） g/（L·h）和（474.99±194.96）g/（L·h），AUC（0-∞）分別為（332.44±1.66） g/（L·h）和（518.64±231.39）g/（L·h），除t1/2α外，兩組之間的藥代動力學(xué)參數(shù)具有顯著差異（p<0.05）。本方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，可用于人參皂苷Re的體內(nèi)藥代動力學(xué)比較研究。

關(guān)鍵詞 人參皂苷Re； 中波紫外線輻射； 藥代動力學(xué)

1 引 言

紫外線輻射具有強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，長期暴露于紫外輻射，尤其是中波紫外線（Ultraviolet B，UVB），對皮膚可產(chǎn)生強(qiáng)烈的光損傷，被照射部位真皮血管擴(kuò)張，皮膚會出現(xiàn)紅斑、炎癥、老化現(xiàn)象，嚴(yán)重者可引發(fā)皮膚癌[1～5]。過量的UVB照射可導(dǎo)致機(jī)體中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）下降，由照射產(chǎn)生的自由基及活性氧可以攻擊免疫器官，導(dǎo)致其氧化損傷，免疫細(xì)胞的及細(xì)胞因子分泌發(fā)生改變，繼而機(jī)體的免疫功能逐漸減弱，甚至產(chǎn)生免疫抑制作用[6～8]。藥物代謝動力學(xué)是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規(guī)律的學(xué)科。近年來，質(zhì)譜技術(shù)在藥代動力學(xué)研究方面的應(yīng)用較為廣泛[9～11]，但是機(jī)體受UVB輻射損傷狀態(tài)下的相關(guān)代謝研究鮮有報道。

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）具有良好的抗輻射功效，人參皂苷作為人參的主要活性成分之一，在抗氧化、清除氧自由基和抗衰老等方面具有較強(qiáng)的活性[11～15]。人參皂苷Re的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占總皂苷的30%，具有清除自由基，保護(hù)不飽和脂肪酸等活性，有顯著的抗衰老功效，發(fā)揮著重要的抗腫瘤和抗癌作用[16～20]。

本研究利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測人參皂苷Re經(jīng)正常和UVB輻射損傷模型大鼠口服后的血藥濃度變化情況，計算相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)，比較兩組間的差異，為初步揭示紫外線輻射對機(jī)體代謝的影響提供理論依據(jù)，同時也對人參皂苷Re的藥用開發(fā)與基礎(chǔ)研究提供了參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200型液相色譜系統(tǒng)，6520 Accurate Q-TOF儀， TSQ ENDURA質(zhì)譜儀，配有ESI離子源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，均購自美國Agilent公司；Thermo UltiMate 3000系統(tǒng)；TDL-5-4型離心機(jī)（Anke公司），WS2-261-79高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱（美國熱電公司）；窄譜中波紫外線光源采用飛利浦紫外線燈（TL-01，峰值311～313 nm）；紫UV-340A外線輻照計（臺北路昌公司）。

乙腈（色譜級，美國Tedia公司）；甲酸（色譜級，美國Sigma公司）；人參皂苷Re和人參皂苷Rf對照品（純度>98%，吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室）；超純水由美國Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)制得。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠12只，體重（180±20） g，動物合格證號：SCXK-（遼）2015-0001，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司動物中心提供。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下（濕度 50%±10%；溫度（25±2）℃；12 h 晝夜循環(huán)）進(jìn)食進(jìn)水，放入代謝籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，實(shí)驗(yàn)過程中所有動物都受到精心養(yǎng)護(hù)。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm×3.0 mm，2.7 μm），柱溫35℃。流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0 min，20% B；0～2 min，20% B；2～4 min，20%～35% B；4～7 min，35%～41% B； 7～9 min，41%～70% B；9～10 min，70%B。 流速 0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：碰撞氣為超純氦，鞘氣和輔助氣為高純氮；電噴霧電離（ESI），檢測模式為負(fù)離子模式；鞘氣壓力：35 psi；輔氣壓力：10 psi；離子轉(zhuǎn)運(yùn)管溫度：325℃；氣化溫度：275℃；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測。

2.4 溶液配制及樣品處理

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 稱取人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用甲醇稀釋至1.0 mL，配成濃度為1.0 mg/mL母液，然后用甲醇稀釋成0.5、1.0、10.0和100.0 μg/mL的工作液。稱取人參皂苷Rf 標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，以甲醇定容至1.0 mL，配制成1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，然后用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的工作液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白大鼠血漿100 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，每個樣品中加入不同質(zhì)量的人參皂苷Re，配成15、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000和20000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100 μL 1 μg/mL人參皂苷Rf 作為內(nèi)標(biāo)， 混勻，加入200 μL冰甲醇，渦旋30 s，12000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣檢測。以G-Re 濃度為橫坐標(biāo)x，以G-Re 與G-Rf的峰面積比值（A/Ai）為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行直線回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)[21]的方法對大鼠造模[21]，取上述雄性大鼠12只，用嬰兒理發(fā)器剃除整個大鼠背部（尾部至頸部）的絨毛，每2天剃毛1次，實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分成空白對照組與UVB模型組，每組6只。UVB照射時，大鼠背部暴露在距光源30～42 cm處，每次劑量為170 mJ/cm2，連續(xù)UVB照射5天，從第6天開始，每2天照射一次，共14天（10次），UVB總劑量為2.38 J/cm2，照射后送回動物飼養(yǎng)室。

空白對照組與UVB模型組繼續(xù)按照上述照射條件飼養(yǎng)至第15 d，口服G-Re皂苷（混懸于0.5% CMC-Na） 50 mg/kg劑量混合液，在0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48和72 h眼眶取血，每個時間點(diǎn)取血0.5 mL，血液冷卻后3000 r/min離心10 min，取上清血漿100 μL，測定前加入100 μL G-Rf內(nèi)標(biāo)液和 300 μL冰甲醇，渦旋30 s，以12000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，于4℃保存， 待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的鑒定及優(yōu)化

利用高分辨飛行時間質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下對人參皂苷Re、Rf進(jìn)行定性分析，結(jié)果見圖1。分別在正、負(fù)離子模式下，采用直接進(jìn)樣方式，優(yōu)化G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf的三重四級桿質(zhì)譜的分析條件：毛細(xì)管電壓為2.0 kV；離子傳輸管溫度為200400℃；霧化器溫度為200400℃；鞘氣流速2050 psi；輔助氣流速0.3 L/min；自動優(yōu)化G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf在多反應(yīng)檢測（MRM）時所產(chǎn)生的碎片離子種類和所需碰撞能量。本研究選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析，詳細(xì)參數(shù)見表1。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 專屬性 將供試空白血漿與空白血漿中加入待測物和內(nèi)標(biāo)物后得到的總離子流圖（Total ion chromatorgram， TIC）和給藥后不同時間實(shí)測色譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果表明，血漿中所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)物的測定，被測物峰形良好。G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf 的保留時間分別為4.61和6.52 min。空白大鼠血漿樣品，空白大鼠血漿中加入G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf樣品，給藥1 h后的大鼠血漿樣品如圖2所示。

3.2.2 線性關(guān)系 將G-Re與內(nèi)標(biāo)G-Rf的峰面積比值（y）與G-Re濃度（x）進(jìn)行最小二乘線性回歸。結(jié)果表明，在15～20000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，得到標(biāo)準(zhǔn)曲回歸方程為y=0.0003x+0.0009（R=0.999）， 檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為4.0 ng/mL和13.5 ng/mL。

3.2.3 精密度與準(zhǔn)確度 采用高、中、低3個濃度的G-Re血漿QC樣本，每個濃度進(jìn)行6個樣本分析，連續(xù)測定3天，計算日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，表明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.2.4 回收率 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，每個濃度進(jìn)行6個樣本分析，將空白血漿中先加入G-Re，處理后計算所測得峰面積，與空白血漿處理后加入相同量G-Re所測得峰面積比值的百分率進(jìn)行比較，考察樣品的提取回收率，結(jié)果見表2。G-Re回收率范圍為89.6%～91.9%， RSD<15%， 表明本方法可以滿足血漿類生物樣本的檢測要求。

3.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，與等量G-Re的純標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積相對應(yīng)，測量基質(zhì)效應(yīng)， 基質(zhì)效應(yīng)（%）=A/B×100， 其中A為QC樣本中測得G-Re的峰面積， B為等量G-Re標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，每個濃度進(jìn)行6個樣本分析，結(jié)果如表2所示，G-Re在3個濃度下的基質(zhì)效應(yīng)在93.2%～97.8%之間，表明本方法可有效避免基質(zhì)對人參皂苷Re測定的影響。

3.2.6 穩(wěn)定性 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，在不同的儲存條件（室溫24 h，20℃至少15天，3次凍融循環(huán)后和4℃下保存8 h）下， 3個QC水平的測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在上述條件下，人參皂苷Re樣本溶液較為穩(wěn)定，可滿足分析要求。

3.3 人參皂苷Re的藥代動力學(xué)比較研究

利用本方法研究大鼠口服50 mg/kg的G-Re后的藥代動力學(xué)行為。用DAS 2.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其主要藥代動力學(xué)參數(shù)詳見表4。圖3為口服后空白組和模型組大鼠的平均血液藥物濃度-時間曲線， 通過赤池信息標(biāo)準(zhǔn)（Akaike's information criterion， AIC） 進(jìn)行房室模型分析，結(jié)果表明，G-Re在兩組大鼠體內(nèi)代謝符合二室模型特征。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗(yàn)分析，與正常狀態(tài)下的藥動學(xué)參數(shù)比較， 在UVB輻射條件下， G-Re在大鼠體內(nèi)的t1/2β、 AUC、 Tmax和K21均高于正常組，兩者之間有顯著性差異（p<0.05），提示在UVB狀態(tài)下G-Re在大鼠體內(nèi)的吸收明顯升高，而Cmax、 K12和K10無統(tǒng)計學(xué)差異，提示在大鼠體內(nèi)的消除沒有發(fā)生明顯變化[22]。有研究報道，在輻射劑量為800 mJ/cm2 UVB急性照射下，即可導(dǎo)致裸鼠肝細(xì)胞GSH與SOD活性水平顯著下降[23]。本實(shí)驗(yàn)在UVB照射劑量下，模型組大鼠肝臟可能造成了一定的氧化損傷，從而導(dǎo)致其對G-Re的吸收、分布、代謝及排泄過程產(chǎn)生了影響[23] 。

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-QQQ-MS/MS 法對正常和UVB輻射損傷模型大鼠體內(nèi)G-Re含量的快速檢測方法。利用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用的優(yōu)勢，對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，對檢測的G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf都分別選擇一個定性離子對和一個定量離子對，最終實(shí)現(xiàn)對G-Re的定量分析。此方法可在10 min內(nèi)完成G-Re的分析，檢測時間短、線性關(guān)系較好、方法回收率高、穩(wěn)定性良好，可滿足分析要求。本實(shí)驗(yàn)對正常大鼠和UVB輻射大鼠體內(nèi)的人參皂苷Re藥代動力學(xué)比較研究，對比兩組代謝檢測結(jié)果，UVB輻射條件下測得大鼠體內(nèi)的人參皂苷Re含量較高，說明中波紫外線影響人參皂苷Re在動物體內(nèi)代謝過程，其詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

References

1 Moehrle M. Clin. Dermatol.， 2008， 26（1）： 12-15

2 Halliday G M， Damian D L， Rana S， Byrne S N. J. Dermatol.Sci.， 2012， 66（3）： 176-182

3 Griffin L L， Ali F R， Lear J T. Clin. Med.， 2016， 16（1）： 62-65

4 Ravi P R， Vats R. J. Pharm. Pharmacol.， 2017， 69（7）： 823-833

5 Elhennawy M G， Lin H S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2017， 142： 35-41

6 Etemadi L， Pettersson L M E， Danielsen N. Peptides， 2017， 1： 87： 71-83

7 Gonzalez V C， Beheregaray A C M， Peres B M， Sallis E S V， Varela A S， Trindade G S. Photochem Photobiol.， 2015， 91（4）： 895-900

8 Hao O Y， Joseph S， Curtis C， Yohini A， Darrell R. J. Am. Acad. Dermatol.， 2012， 6（67）： 1220-1227

9 ZHANG Zhe， TENG Ya-Ran， LYU Zi-Yan， WU Wei， LIU Shu-Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（2）： 191-198

張 喆， 滕亞然， 呂子燕， 吳 巍， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2017， 45（2）： 191-198

10 WANG Qian-Qian， ZHANG Jing， PI Zi-Feng， LIU Shu， SONG Feng-Rui， LIU Zhi-Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（7）： 997-1001

王倩倩， 張 靜， 皮子鳳， 劉 舒， 宋鳳瑞， 劉志強(qiáng). 分析化學(xué)， 2014， 42（7）： 997-1001

11 HUANG Yong， HE Feng， ZHENG Lin， ZHANG Zhi-Rong， LAN Yan-Yu， WANG Yong-Lin. Chin.J.Pharm. Anal. ， 2012， （01）： 1-6

黃 勇， 何 峰， 鄭 林， 張治蓉， 蘭燕宇， 王永林. 藥物分析雜志， 2012， （01）： 1-6

12 WANG En-Peng， CHEN Xin， XU Xin， WANG Hong-Xin， ZHANG Hong-Chang. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research， 2013， 8（24）： 1873-1876

王恩鵬， 陳 新， 許 新， 王洪鑫， 張洪長. 時針國醫(yī)國藥， 2013， 8（24）： 1873-1876

13 Biswas T， Mathur A K， Mathur A. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2017， 101（10）： 1-2

14 Leena R， Lasse H， Dunlop T W， Petri P， Genevieve B， Maarit K， Malvehy T， Puig S. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed.， 2017， （6）： 2728-2736

15 Cho W S， Chung W S， Lee S W， Leung A N， Cheng C H， Yue K M. Eur. J. Pharmacol.， 2006， 550（1）： 173-179

16 LUO Lin-Ming， SHI Ya-Ning， JIANG Yi-Na， ZHAN Ji-Hua， QIN Li， CHEN Nai-Hong. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2017， （3）： 582-596

羅林明， 石雅寧， 姜懿納， 詹濟(jì)華， 覃 麗， 陳乃宏. 中草藥， 2017， （3）： 582-596

17 Yu S S， Zhou X L， Li F， Xu C C， Zheng F， L J， Zhao H X， Dai Y L， Liu S Y， Feng Y. Sci. Rep.， 2017， 7（138）： 1-10

18 Zhang Y C， Li G J， Chao Y， Yang B， Yang H J， Xu H Y， Huang L Q. Molecules， 2014， 19（11）： 17381-17399

19 Yuri O， Lim H W， Kim K， Lim C J. Acta Pharmaceutica Sinica， 2016， 71（7）： 413-419

20 LUO Tai-Min， LI Jin-Qi， TONG Rong-Sheng. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine， 2014， （2）： 332-335

羅太敏， 李晉奇， 童榮生. 中華中醫(yī)藥雜志， 2014， （2）： 332-335

21 WANG En-Peng， SUN Yan， YUE Hao， CHEN Huan-Wen， WANG Yang， CHEN Chang-Bao， LIU Shu-Ying. Chinese J.Anal.Chem.， 2016， 44（9）： 1410-1418

王恩鵬， 孫 巖， 越 皓， 陳煥文， 王 洋， 陳長寶， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2016， 44（9）： 1410-1418

22 XU Wei-Zhe， ZHAO Yan， QIN Yi， XIA Bin-Bin， GONG Wen-Wen， XU Ping-Xiang， XUE Ming. Journal of International Pharmaceutical Research， 2016， （02）： 336-340

徐唯哲， 趙 妍， 秦 一， 夏彬彬， 宮雯雯， 徐平湘， 薛 明. 國際藥學(xué)研究雜志， 2016， （02）： 336-340

23 Svobodova A R， Galandakova A， Sianska J. Biol Pharm Bull， 2011， 34（4）： 471-479