甘薯IbGL3的克隆和表達(dá)分析

徐靖 朱紅林 朱家紅 符策強(qiáng) 韓義勝 唐力瓊 王敏芬 王新華 王效寧

摘 要：紫色甘薯富含花青素，具有較高的食用和藥用價(jià)值?；ㄇ嗨氐纳锖铣墒艿浇Y(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的控制。bHLH（basic helix-loop-helix protein）轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)多個(gè)花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，在花青素生物合成途徑中具有重要的調(diào)控作用，但目前在甘薯中還沒(méi)有關(guān)于bHLH調(diào)控花青素生物合成的相關(guān)報(bào)道。

為進(jìn)一步了解IbGL3基因在甘薯花青素生物合成的功能和作用機(jī)理，該研究根據(jù)甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR技術(shù)在甘薯中克隆了一個(gè)2 120 bp的bHLH基因IbGL3，該基因包含一個(gè)1 878 bp的開放閱讀框，編碼625個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量69.08 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.20。IbGL3蛋白和其他植物中類黃酮合成相關(guān)的bHLH蛋白具有較高的同源性，都包含保守的MIR區(qū)、bHLH結(jié)構(gòu)域和ACT類似結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，IbGL3與其他植物類黃酮相關(guān)bHLH蛋白聚為一類，屬于Ⅲf 亞類成員。表達(dá)結(jié)果顯示，IbGL3基因在紫色甘薯中的表達(dá)量最高，在淺紫色甘薯中的表達(dá)量次之，在白色甘薯中表達(dá)量最低，與花青素積累正相關(guān)，因此推測(cè)其在甘薯花青素生物合成途徑中具有重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：甘薯，花青素，bHLH轉(zhuǎn)錄因子，基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）10-1356-07

Abstract：Anthocyanin-rich purple sweet potatos have high edible and medicinal values. Anthocyanin biosynthesis is controlled by structural genes and regulatory genes. The basic helix-loop-helix protein（bHLH ） transcription factor plays an important role in anthocyanin biosynthesis by regulating multiple structural genes. However，there are no reports about bHLH regulating anthocyanin biosynthesis in sweet potato. In order to further understand the function and molecular mechanism of IbGL3 in the biosynthesis of anthocyanins in sweet potato，in this study，a bHLH gene named IbGL3 was cloned in Ipomoea batatas based on transcriptome data and RT-PCR technology. The full-length cDNA of IbGL3 was 2 120 bp，containing 1 878 bp opening reading frame（ORF），and encoding 625 amino acids. The encoded protein of IbGL3 has a molecular weight of 69.08 kD and the theoretical isoelectric point（pI） of 5.20. The IbGL3 protein had highly conserved MIR motif，bHLH domain and ACT domain，shared high identities and similar domains with bHLH proteins involved in anthocyanin biosynthesis from other plants. Phylogenetic analysis showed that IbGL3 was clustered in the Ⅲ f bHLH subgroup together with other anthocyanin-related bHLH proteins. The expression of IbGL3 in the storage root of different sweet potato varieties was detected by quantitative polymerase chain reaction（qPCR）. The results indicated that IbGL3 was mainly expressed in purple-fleshed sweet potato，followed by light purple-fleshed sweet potato and weakly expressed in white-fleshed sweet potato，and its expression was positively related to the accumulation of anthocyanin Ipomoea batatas. The results showed that IbGL3 may be involved in regulating anthocyanin biosynthesis in Ipomoea batatas.

Key words：Ipomoea batatas，anthocyanin，bHLH transcription factor，gene expression

花青素是一種存在于植物體內(nèi)的類黃酮化合物，不僅在植物的花著色、抵御紫外線傷害、防止病源微生物侵襲等過(guò)程中起決定作用，還具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健功效（Panche et al，2016; Lila，2008）。花青素生物合成途徑在模式植物中已得到廣泛研究，相關(guān)基因已在多種植物中得到分離（Hichri et al，2011; Albert et al，2014; Wang et al，2015）。植物類花青素生物合成主要受兩類基因控制：一類是結(jié)構(gòu)基因，編碼與類黃酮生物合成有關(guān)的各種酶類;另一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)參與對(duì)類黃酮次生代謝的調(diào)控（Hichri et al，2011; Wang et al，2015）。研究證實(shí)，花青素的生物合成主要受到轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40組成的MYB-bHLH-WD40（MBW）轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的調(diào)控（Xu et al，2015）。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是一類含有basichelix-loop-helix（bHLH） 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為12個(gè)亞類（I-Ⅻ），而調(diào)控類黃酮生物合成的bHLH蛋白主要集中在Ⅲf 亞類（Xu et al，2015; Heim et al，2003）。擬南芥中與調(diào)控花青素生物相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要有TT8/AtbHLH42、GL3/AtbHLH1和 EGL3/ AtbHLH2（Gonzalez et al，2008）。首個(gè)調(diào)控花青素生物合成的bHLH基因在玉米中得到分離和鑒定（Chandler et al，1989）。目前，已在菊花（Chrysan themums）、蘋果（Malus domestica）和荔枝（Litchi chinensis）等多種植物中得到分離和鑒定，這些轉(zhuǎn)錄因子大都能激活多個(gè)類黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)（Xiang et al，2015; Xu et al，2017; Lai et al，2016）。

甘薯是世界上廣泛種植的糧食和經(jīng)濟(jì)作物（Hu et al，2016）。作為一種聯(lián)合國(guó)糧食農(nóng)業(yè)組織推薦的健康食品，甘薯富含淀粉、纖維素及多種有益的次生代謝物，如β胡蘿卜素和花青素（Liu et al，2017）。不同的甘薯品種中，紫肉甘薯富含的花青素，具有較高的食用和藥用價(jià)值（Li et al，2013）。相對(duì)于模式植物而言，甘薯花青素生物合成和調(diào)控機(jī)理研究相對(duì)滯后，目前還沒(méi)有關(guān)于bHLH蛋白調(diào)控花青素生物合成的相關(guān)報(bào)道（李霞等，2014）。在先前的研究中，筆者通過(guò)對(duì)不同肉色甘薯品種進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選到一批與花青素積累相關(guān)的差異表達(dá)基因，獲得1條與其它植物中GL3高度同源的EST序列。本研究將克隆IbGL3基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測(cè)其表達(dá)特征與花青素積累的相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示該基因在甘薯花青素生物合成中的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘薯材料種植于海南農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)基地。選取種植5個(gè)月后生長(zhǎng)發(fā)育基本一致的白色、淺紫色和紫色甘薯品種的新鮮塊根為實(shí)驗(yàn)材料用于RNA提取和花青素的測(cè)定。

1.2 花青素提取和測(cè)定

采用1%鹽酸溶液作為提取液提取甘薯塊根花青素，采用分光光度法測(cè)定花青素含量，具體參考劉桂玲等（2007）的方法。

1.3 核酸提取和cDNA的合成

甘薯塊根中RNA提取采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒;按照Thermo Scientific First Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4 基因克隆和序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋為GL3的EST序列，設(shè)計(jì)5′端特異引物PGL3F：5′-GCCCAGTTTGTTCAAGAGCC-3′和5′端引物PGL3R：5′-AGTTAGGGATAAACCTTTGCT-3′，以甘薯cDNA為模板對(duì)IbGL3進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的條帶與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送諾賽基因公司測(cè)序。利用ExPASy在線軟件（https：//www.expasy.org/）分析預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸組成、分子式、分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和親水性等;利用PSORT（http：//psort1.hgc.jp/form.html）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位;利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽分析;利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu);利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析;利用MEGA7進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.5 基因表達(dá)分析

利用SYBR Select Master Mix試劑盒在Mx3005P Real-Time PCR System上進(jìn)行qPCR分析。內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，引物序列為ACT-F（5′-CTGGTGTTATGGTTGGGATGG-3′）和ACT-R（5′-GGGGTGCCTCGGTAAGAAG-3′）;目的基因引物GE3-F（5′-CATCTGGACTGCGAAACTATCC-3′）和GE3-R（5′-GCTGGTGATGGTGACGTTAAT-3′）。qPCR反應(yīng)體積20 μL：10 μL 2×SYBR mix，正反向引物各1 μL（10 μmol·L-1），1 μL cDNA模板，7 μL ddH2O。 qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbGL3的克隆

根據(jù)在甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的IbGL3基因的EST序列，設(shè)計(jì)特異引物對(duì)該基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條2 100 bp左右的特異條帶（圖1）。將目的片段連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到結(jié)果一致，將該基因命名為IbGL3。本研究獲得的IbGL3基因全長(zhǎng)2 120 bp，包含一個(gè)1 878 bp完整的開放閱讀框。

2.2 IbGL3的分子特征

IbGL3編碼蛋白由625個(gè)氨基酸組成，其中絲氨酸（Ser）最多，有63個(gè)，占比達(dá)到10.1%。IbGL3蛋白分子式為C2982H4784N854O982S24，預(yù)測(cè)分子量為69.08 kD，理論等電點(diǎn)5.20，不穩(wěn)定系數(shù)為43.06，被歸類為不穩(wěn)定蛋白;總平均疏水指數(shù)為-0.555，屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示IbGL3定位在細(xì)胞核內(nèi)的可能性最大，核定位信號(hào)（PSSKKRKASKT）位于C-端。信號(hào)肽分析顯示IbGL3蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示IbGL3蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.3 IbGL3的進(jìn)化和同源性分析

為進(jìn)一步了解IbGL3的功能和進(jìn)化特征，將IbGL3氨基酸序列與擬南芥不同亞類的bHLH蛋白及其他植物中已鑒定的與花青素合成相關(guān)的bHLH蛋白一起聚類分析，結(jié)果顯示IbGL3與TT8、GL3和EGL3聚在一起，屬于Ⅲf 亞類成員（圖2）。目前，在不同植物中鑒定的調(diào)控花青素生物合成的bHLH蛋白大都屬于Ⅲf 亞類，這說(shuō)明IbGL3可能具有調(diào)控甘薯花青素生物合成的功能。將IbGL3和其他調(diào)控花青素的bHLH蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白都包含3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：N端與MYB蛋白互作的MIR區(qū)、bHLH結(jié)構(gòu)域和位于C端的ACT類似結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.4 IbGL3表達(dá)與花青素積累的相關(guān)性分析

利用定量PCR技術(shù)檢測(cè)了IbGL3在不同肉色甘薯塊根中的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)IbGL3在紫色甘薯中的表達(dá)量最高，在淺紫甘薯中的表達(dá)量次之，在白色甘薯中表達(dá)量最低，與甘薯花青素含量正相關(guān)（圖4）。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類真核生物中存在最廣泛的一大類轉(zhuǎn)錄因子，在植物細(xì)胞大小和命運(yùn)調(diào)控、激素響應(yīng)、金屬體內(nèi)平衡、光形態(tài)發(fā)生和花器官發(fā)育等多種生理過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用（Heim et al，2003; Feller et al，2011; Yang et al，2017）。調(diào)節(jié)花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子大都屬于Ⅲf 亞類，通過(guò)改變或過(guò)表達(dá)花青素合成相關(guān)bHLH基因能夠影響植物體內(nèi)花青素的積累（Xu et al，2015;Li et al，2016; Lim et al，2017）。本研究在甘薯中克隆一個(gè)編碼bHLH與擬南芥GL3同源的基因IbGL3，其編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 878 bp，編碼625個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，IbGL3 蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，說(shuō)明IbGL3在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能。進(jìn)化分析顯示，IbGL3屬于Ⅲf亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，與其他植物中花青素合成相關(guān)的bHLH蛋白具有較高的同源性，都含有保守的MIR區(qū)、bHLH結(jié)構(gòu)域和ACT結(jié)構(gòu)域。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子通常與MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用協(xié)同調(diào)控花青素的生物合成，MIR區(qū)是bHLH與MYB蛋白互作區(qū)位于bHLH的N端（Heim et al，2003; Feller et al，2011）。bHLH結(jié)構(gòu)域是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能形成同源或異源二聚體，這是bHLH蛋白與DNA結(jié)合的前提（Heim et al，2003; Feller et al，2011）。ACT類似結(jié)構(gòu)域位于C端，是一段富含酸性氨基酸的序列，該區(qū)域能夠與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄;此外，該區(qū)域也與bHLH二聚體的形成有關(guān)（Feller et al，2006）。功能預(yù)測(cè)分析表明IbGL3可能具有調(diào)控甘薯花青素生物合成的功能。表達(dá)分析顯示，IbGL3在紫色甘薯中大量表達(dá)，在淺紫色甘薯中的表達(dá)量次之，而在白色甘薯中表達(dá)量最低，與花青素積累正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明IbGL3可能是甘薯花青素生物合成的調(diào)控基因。下一步將進(jìn)一步研究IbGL3在花青素生物合成中的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)理，為甘薯花青素生物合成遺傳改良奠定基礎(chǔ)。