LC-ESI-MS/MS測(cè)定白酒中甜味劑紐甜的方法研究

周玉，董孝元，余義，劉莎，唐艷榮，陳佳麟，時(shí)宏偉，*

（1.武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050；2.健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北武漢430050）

甜味劑是改善食品口味的一種食品添加劑，有著低熱量、高甜度、適合糖尿病病人適用等特點(diǎn)而成為蔗糖替代品在食品中廣泛使用。紐甜是一種新型的非營(yíng)養(yǎng)高倍甜味劑，甜度為蔗糖的7 000倍～13 000倍，口味純正，甜感清爽，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，紐甜的安全性、有效性、穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性及環(huán)保性等多方面的系統(tǒng)評(píng)價(jià)得出紐甜為可取代阿斯巴甜且具廣闊應(yīng)用前景的二肽類甜味劑[1-4]。甜味劑盡管應(yīng)用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[5]。

白酒是我國(guó)的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風(fēng)味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風(fēng)格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘冽、醇厚、綿軟，但是這種甜味是來自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑。風(fēng)味化學(xué)研究表明，味覺是由一定的呈味物質(zhì)引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因?yàn)榫浦泻幸欢康奶鹞段镔|(zhì)，如高級(jí)醇、多元醇、氨基酸等，這些甜味物質(zhì)，對(duì)于名優(yōu)白酒，是由其特殊的生產(chǎn)工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發(fā)酵，就是為了有利于醇甜物質(zhì)的生成，無需另行添加[6-10]。

人工合成甜味劑可能對(duì)人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國(guó)家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出。所以對(duì)于白酒中甜味劑的測(cè)定應(yīng)該做到嚴(yán)格把關(guān)，防止行業(yè)和白酒企業(yè)中出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品，對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于紐甜的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-17]、高效液相色譜法[18-19]、離子交換色譜法[20]、毛細(xì)管電泳法[21]、氣相色譜法[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜（規(guī)格100 mg，儲(chǔ)存溫度-20℃）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：美國(guó)Baker公司；乙酸（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水（規(guī)格600 mL）：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；有機(jī)濾膜（孔徑0.22 μm）、全玻璃微孔過濾器（規(guī)格1 000 mL）：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.000 1 mg）紐甜標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL），配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)使用需要用蒸餾水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為 0.1%乙酸溶液，B 為甲醇；流動(dòng)相體積比：A ∶B=20 ∶80；流速：0.4 mL/min；柱溫箱：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)模式；干燥氣體溫度：325℃；干燥氣體流速：6 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采取直接進(jìn)樣的方式，將目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜，分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式全掃描檢測(cè)，得到一級(jí)質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再用惰性氣體氮?dú)夤粼撃鸽x子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于負(fù)離子模式，因此，本方法選擇正離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM））對(duì)選定的定性離子和定量離子對(duì)碎裂電壓、碰撞能、保留時(shí)間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測(cè)離子豐度和信號(hào)達(dá)到最佳。正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 紐甜的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters for analysis of neotame

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行樣品分離。結(jié)果表明，用0.1%乙酸-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇，故本方法最終選用0.1%乙酸-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。紐甜在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖，見圖1。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照Gan Zhiwei，Pro bir Kumar Ojha等[23-24]的方法，將紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋，分別配制成5種濃度為50、100、200、500、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.5節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2。

圖1 紐甜的多反映監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 Chromatogram of neotame in MRM mode

圖2 紐甜的線性相關(guān)系數(shù)Fig.2 Linear correlation coefficients of neotame

結(jié)果顯示，在50 μg/L～1 000 μg/L的濃度范圍內(nèi)，所有分析物的質(zhì)量濃度x（μg/mL）和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.999 99；以性噪比為3確定檢出限為50 μg/L，以性噪比為 10 確定定量限為 200 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照 H.Ozer，Elisabeta-Irina Geana等[25-26]的方法，采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，選擇常見的濃香型和兼香型兩個(gè)不同香型白酒酒樣及乙醇進(jìn)行的紐甜檢測(cè)試驗(yàn)，成品白酒1、2和乙醇3的紐甜含量均為未檢出，并向兩個(gè)樣品中分別添加200、500 μg/L二個(gè)濃度水平的紐甜進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定2次。共6組平行，12次檢測(cè)，結(jié)果表明，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差小于2%，且回收率均在85%～105%率范圍內(nèi)，所以該方法的精密度和回收率均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4 與國(guó)標(biāo)法比對(duì)

選擇常見的4種不同類型白酒酒樣添加紐甜，將本方法與國(guó)標(biāo)GB 5009.247-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定》方法進(jìn)行加標(biāo)測(cè)回收率結(jié)果比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見表2。

表2 方法結(jié)果比對(duì)Table 2 Comparison of methods

將本方法和國(guó)標(biāo)方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，兩組數(shù)據(jù)的絕對(duì)偏差小于1，相對(duì)偏差小于5%。國(guó)標(biāo)方法中紐甜的定量限是0.2 mg/L；本方法的檢出限是0.05 mg/L，定量限是0.2 mg/L。結(jié)果表明，本方法可以用于白酒中紐甜的檢測(cè)。相比液相色譜系統(tǒng)，液相質(zhì)譜聯(lián)用儀具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測(cè)時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中甜味劑紐甜化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)，建立了一個(gè)快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量紐甜的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測(cè)范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 99）；檢出限0.05 mg/L；定量限 0.2 mg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且與國(guó)標(biāo)中的檢測(cè)方法相比檢出限更低，能更加有效的監(jiān)控白酒中紐甜的含量，綜上所述該方法可以對(duì)紐甜進(jìn)行實(shí)際的定性定量檢測(cè)。

[1]姚明靜,季斌,劉麗萍,等.白酒中常見的七種甜味劑檢測(cè)方法及來源的研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2017(5):1-6

[2]朱明婧,劉博,李飛飛.天然甜味劑研究進(jìn)展與開發(fā)前景分析[J].中國(guó)調(diào)味品,2015(11):136-140

[3]楊雙春,劉慧芳,王健,等.國(guó)內(nèi)外人工合成的非能量型甜味劑研究現(xiàn)狀[J].食品工業(yè),2013(4):181-184

[4]Bryant Charlotte,Mclaughlin John.Lowcalorie sweeteners:Evidence remain slacking for effects on human gut function[J].Physiology&behavior,2016(14):62-64

[5]楊君,王建華,劉靖靖,等.食品中甜味劑的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)分析計(jì)量,2013(5):100-103

[6]孫棣,馮永渝,梁桂娟.白酒中甜味劑的檢測(cè)及其來源的探討[J].中國(guó)釀造,2015(7):142-146

[7]Zhu L,Wang G,Dong B.Effects of sweetener neotame on diet preference,performance and hematological and biochemical parameters of weaned piglets[J].Animal Feed Science and Technology,2016(5):14

[8]M C Yebra-Biurrun.Sweeteners[M].Netherlands:ElsevierInc,2013:12-13

[9]劉石雪,唐麗云.高效液相法測(cè)定白酒中紐甜含量影響因素的探究[J].釀酒科技,2017(6):9-11

[10]潘紅,邢卉研,胡麗,等.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀同時(shí)測(cè)定白酒中5種甜味劑含量[J].科技經(jīng)濟(jì)導(dǎo)刊,2016(7):100-101

[11]吳世嘉,王洪新,陶冠軍.超高壓液相色譜—質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定白酒中6種微量甜味劑的方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010,29(5):670-675

[12]王麗,俞心愉,李磊.超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速檢測(cè)白酒中4種甜味劑[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2014,24(22):3244-3246,3250

[13]梅婕,司冠儒,張溫清,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白酒中6種甜味劑[J].釀酒科技,2016(3):122-124

[14]Jian-YeGUI,Wei SUN,Chen-Ling ZHANG,et al.An Innovative Approach to Sensitive Artificial Sweeteners Analysis by Ion Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2016,44(3):32-33

[15]Romina Shah,Samantha Farris,LowriS DeJager,et al.Anovel method for the simultaneous determination of 14 sweeteners of regulatory interest using UHPLC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(2):12-14

[16]牛之瑞,王秀君,于毅濤,等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時(shí)測(cè)定白酒中8種甜味劑[J].食品科學(xué),2016(2):178-181

[17]Hiroaki Sakai,Azusa Yama shita,Masayoshi Tamura,et al.Simultaneous determination of sweeteners inbeverages by LC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(4):62-63

[18]劉芳,王彥,王玉紅,等.固相萃取-高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè)食品中5種人工合成甜味劑[J].色譜,2012(3):292-297

[19]Kakigi Y,Suzuki T,Icho T,et al.Classification of stevia sweeteners in soft drink susing liquid chromatography and time-of-flight mass spectrometry[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2013,30(12):21-22

[20]桂建業(yè),孫威,張辰凌,等.離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析環(huán)境水體中痕量人工甜味劑[J].分析化學(xué),2016(3):361-366

[21]薛洪寶,張暉,梁麗麗,等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定食品中5種甜味劑含量[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014(3):315-320

[22]阮麗萍,蔡梅,吉文亮,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中8種人工合成甜味劑[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2013(4):331-335

[23]Gan Zhiwei,Sun Hongwen,Wang Ruonan,et al.Anovel solid-phase extraction for the concentration of sweeteners in water and analysis by ion-pair liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2013(4):52-55

[24]Probir Kumar Ojha,KunalRoy.Development of arobust and validated 2D-QSPR model for sweetness potency of diverse functional organic molecules[J].Food and Chemical Toxicology,2017(1):32-36

[25]Ozer H,Psimouli V,Ozcan N,et al.Oreopoulou.Ringtrial for the simultaneous analysis of sweeteners and preservatives in soft drinks[J].QualityAssuranceandSafetyofCrops&Foods,2013,5(1):6-12

[26]Elisabeta-Irina Geana,Andreea-Maria Iordache,Roxana Elena Ionete.Simultaneous determination of artificial sweeteners in possible counter feited wines,using high performance liquid chromatography with DAD detection[J].Analele Universitatii“Ovidius”Constanta-Seria Chimie,2012,23(1):14-17