以甾醇為底物微生物法合成甾體類化合物的研究進(jìn)展

金俊，盧夢(mèng)瑤，厲秋岳，吳正章，張鵬，馮文歡，常明，金青哲，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無(wú)錫214122；2.浙江省糧食科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，浙江杭州310012；3.江蘇科鼐生物制品有限公司，江蘇泰興225400）

甾體化合物是一類重要的生命物質(zhì)，被Witzmann博士譽(yù)為“生命的鑰匙”[1]。所有甾體化合物均由環(huán)戊烷多氫菲核（如圖1所示）為母核衍生而來(lái)，其中A、B、C為六元環(huán)，D為五元環(huán)，在C3、C11、C17位上可接羥基或酮基，在C10、C13位上可接角甲基，在C17位上可接烴基，在A或B環(huán)上可有部分雙鍵，這些官能團(tuán)通過(guò)不同的組合進(jìn)而衍生出各類甾體化合物[2]。甾體類化合物按用途主要分為甾體類藥物和甾體類功能食品兩大類：前者主要包括腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素等[3]；后者具有代表性的即為甾醇酯。

圖1 甾體化合物的母核分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The parent structure of steroids

傳統(tǒng)上，制備甾體類化合物多采用溶劑提取法或化學(xué)合成法。溶劑提取法存在著步驟多、得率低和溶劑毒性等缺陷，以從夏風(fēng)信子中制備C-27甾體皂苷為例，需要至少7步提取，用到甲醇、氯仿、乙腈等有機(jī)溶劑，而得率不足0.05‰[1]?；瘜W(xué)合成法彌補(bǔ)了溶劑提取法得率過(guò)低的問(wèn)題，在20世紀(jì)中前半葉廣受關(guān)注，由我國(guó)著名化學(xué)家黃嗚龍研發(fā)的薯蕷皂素為原料制備可的松的工藝，在當(dāng)時(shí)不僅填補(bǔ)了我國(guó)甾體類藥物生產(chǎn)的空白，且使我國(guó)在該領(lǐng)域一度處于世界領(lǐng)先地位。該法發(fā)展至今，我國(guó)甾體類藥物中間體的出口量可達(dá)1 000 t/年，全球市場(chǎng)達(dá)100億美元[4-5]。然而，化學(xué)合成法還是暴露出了步驟多、反應(yīng)條件苛刻、污染嚴(yán)重、立體選擇性差等諸多缺點(diǎn)。因此，具有特異性、環(huán)保理念的微生物合成法制備甾體類化合物逐漸進(jìn)入科學(xué)界視眼。

早期的微生物合成法多以植物皂素為原料、以細(xì)胞色素P450酶為催化劑，其中植物皂素多為薯蕷皂素、劍麻皂素和番麻皂素等[6]。但自20世紀(jì)70年代以來(lái)，植物皂素的提取遇到了瓶頸[7-9]：1）薯蕷皂素的重要來(lái)源黃姜，不能保證連續(xù)產(chǎn)出，資源日漸枯竭；2）提取植物皂素過(guò)程中使用的酶、酸和有機(jī)溶劑會(huì)使排放的廢水pH值、生物需氧量和化學(xué)需氧量等指標(biāo)超標(biāo)；3）提取殘?jiān)壳盁o(wú)法二次利用，經(jīng)填埋處理具有污染地下水的潛在危險(xiǎn)性。這些因素促使國(guó)內(nèi)外一些公司開始尋找和開發(fā)新的甾體類藥物原料。

隨著食用油脂工業(yè)的發(fā)展，毛油經(jīng)堿煉脫酸、蒸汽脫臭等處理后會(huì)產(chǎn)生大量富含甾醇的副產(chǎn)物。甾醇中以植物甾醇最為人所知，它同樣以圖1的母核為基本結(jié)構(gòu)，且資源豐富，被認(rèn)為是工業(yè)化制備甾體類化合物的理想原料。以米糠油為例，其堿煉后的皂渣（提取谷維素后的皂腳）中植物甾醇含量可達(dá)15%～20%，其中β-谷甾醇占62%～72%，而其通過(guò)4步生物轉(zhuǎn)化即可制成強(qiáng)心苷元（一類用于治療心力衰竭的甾體類藥物）[1，10]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，大豆油皂腳中含有毛油中約50%的植物甾醇，是制備五環(huán)三萜皂苷（可作為藥物或甜味劑）的重要來(lái)源[11-12]。除了常見的植物甾醇外，動(dòng)物膽固醇、真菌甾醇（以麥角甾醇為主）同樣被視為珍貴的合成原料[1，13-14]。目前，研究工作主要集中在以甾醇為原料通過(guò)微生物法制備甾體類藥物（或其中間體）和甾醇酯，但因甾醇和微生物種類繁多，尋求合適的原料以高效合成相應(yīng)的甾體類化合物成為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的前提。本文綜述了甾體類化合物的主要代表，分析了以甾醇為原料合成甾體類藥物和甾醇酯的典型路徑，以期為油脂加工副產(chǎn)物的高效利用提出新的途徑。

1 以甾醇為原料合成甾體類藥物

1.1 甾體類藥物的應(yīng)用

目前，甾體類藥物多達(dá)400余種，為人熟知的有地塞米松、潑尼松、倍他米松、氫化可的松、黃體酮、睪丸酮及其衍生物等[15]，在治療皮炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、內(nèi)分泌疾病和紅斑狼瘡等疾病方面有著舉足輕重的作用。

1.2 甾體類藥物微生物合成法的發(fā)展歷程

在全球范圍內(nèi)，20世紀(jì)中后期處于甾體類藥物微生物合成法研發(fā)的熱潮之中。直至20世紀(jì)90年代，我國(guó)才認(rèn)識(shí)到以甾醇為原料、以微生物為催化劑合成甾體類藥物的迫切性和必要性。中國(guó)科學(xué)院以此立項(xiàng)，當(dāng)時(shí)浙江省糧食科學(xué)研究所作為參加單位配合研發(fā)該課題，以米糠油皂腳中提純的谷甾醇（純度＞90%）為原料進(jìn)行微生物合成，但該課題未有圓滿結(jié)果，當(dāng)時(shí)的研發(fā)成果成了現(xiàn)時(shí)一些小企業(yè)生產(chǎn)出口植物甾醇的技術(shù)資源。

21世紀(jì)初，俄羅斯、中國(guó)、泰國(guó)等國(guó)科學(xué)家相繼開發(fā)出利用分枝桿菌、海洋微生物等催化谷甾醇或混合植物甾醇合成甾體類藥物中間體（4-雄烯二酮：4-androstene-3，17-dione，4AD 和 1，4-雄二烯二酮：androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD）的技術(shù)，并具備產(chǎn)業(yè)化前景[16-18]。目前，該技術(shù)已在國(guó)內(nèi)藥企投產(chǎn)，且部分企業(yè)正在開發(fā)以所制備中間體（4AD和ADD）為原料，進(jìn)一步采用微生物合成甾體類藥物的技術(shù)，并逐步完成了多種孕激素和糖皮質(zhì)激素類甾體藥物生產(chǎn)原料的切換[19]。

1.3 典型合成研究

以甾醇為原料（底物）、以微生物為催化劑合成甾體類藥物這一路徑，通常不能直接合成最終藥物，而是先合成中間體4AD和ADD，它們的結(jié)構(gòu)式如圖2所示，通過(guò)中間體再進(jìn)一步可合成幾乎所有的已知甾體類藥物。該法的主要過(guò)程包括：通過(guò)微生物將甾醇C3位的羥基氧化為酮基；再將C5位的雙鍵引入C4位，同時(shí)降解C17位的側(cè)鏈得到AD；在此基礎(chǔ)上還原C1位引入雙鍵得到ADD。相關(guān)研究主要以谷甾醇、麥角甾醇和混合植物甾醇為原料，見表1。

圖2 4-雄烯二酮和1，4-雄二烯二酮Fig.2 The structures of 4-androstene-3，17-dione and androsta-1，4-diene-3，17-dione

表1 以甾醇為底物微生物法合成AD和ADD的主要研究Table 1 Microbial synthesis of AD and ADD using sterols

然而，目前通過(guò)AD或ADD合成最終藥物的多為化學(xué)法[14]，僅有少數(shù)藥物可實(shí)現(xiàn)全工藝生物法合成。具有代表性的是：通過(guò)Mycobacterium sp.NRRL B-3805催化膽固醇合成睪丸酮[6]；以谷甾醇為原料合成黃體酮[14]；以羊毛甾醇為原料合成C-21甾體或強(qiáng)心苷元[1]。

此外，羽扇豆醇、α-和β-香樹脂醇等普通植物油中不常見的甾醇，被發(fā)現(xiàn)是合成三萜類化合物的重要底物。例如，β-香樹脂醇是合成甘草次酸、齊墩果酸、大豆皂醇、柴胡皂苷的原料；α-香樹脂醇是合成熊果酸、烏索酸的原料；羽扇豆醇是合成樺木酸的原料[12，24-29]。

2 以甾醇為原料合成甾醇酯

2.1 甾醇酯的主要應(yīng)用

甾醇酯被人所認(rèn)知是從它的降膽固醇功能開始的，隨后人們發(fā)現(xiàn)它具有降低心血管發(fā)病率、抗炎、抗癌等一系列功效，因而開始大力開發(fā)這一資源[30]。甾醇酯的使用歷史晚于甾體類藥物，且其主要被應(yīng)用于食品和保健品領(lǐng)域。1999年，日本農(nóng)林省批準(zhǔn)甾醇/甾烷醇酯為保健食品FOSHU的添加劑；2000年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布公告稱從膳食中攝入甾醇/甾烷醇酯可降低膽固醇；2004年，歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)甾醇酯可以作為黃油涂醬、奶制品的原料；2010年，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布第3號(hào)公告批準(zhǔn)植物甾醇酯作為新資源食品，對(duì)于含量90%的植物甾醇酯建議每日食用量不高于3.9 g（嬰幼兒除外）[31]。目前，主要將甾醇酯作為抗氧化劑、乳化劑等應(yīng)用于食品和保健品之中，以提高該類產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)功能[32]。

甾醇酯可通過(guò)結(jié)晶、蒸餾等技術(shù)從油脂加工副產(chǎn)物中提取[33]，例如可從谷物油脂（米糠油、玉米胚芽油等）的皂腳、脫臭餾出物中提取谷甾醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、24-亞甲基環(huán)木菠蘿醇阿魏酸酯、環(huán)木菠蘿醇阿魏酸酯等，其中后兩者是谷維素（米糠油的特征營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）的主要成分[10，34-35]。然而通過(guò)提純這些天然甾醇酯的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，因而對(duì)于甾醇酯合成技術(shù)的開發(fā)成了目前的研究熱點(diǎn)。

2.2 典型合成研究

20世紀(jì)70年代，已開發(fā)出采用甾醇?；D(zhuǎn)移酶催化混合植物甾醇制取甾醇酯的技術(shù)[36]。由于微生物法的反應(yīng)底物基本為從油脂加工副產(chǎn)物中提煉的混合植物甾醇，因此一直以來(lái)將研發(fā)重點(diǎn)放在酶的改進(jìn)和脂肪酸的選擇上，相關(guān)研究見表2。

表2 以甾醇為底物微生物法合成甾醇酯的典型研究Table 2 Microbial synthesis of sterol esters using sterols

然而混合植物甾醇中各單體往往具有各自最適的反應(yīng)條件，這也限制了甾醇酯的高效合成，故以單一甾醇為原料的合成技術(shù)開始受到學(xué)者青睞。近年來(lái)，隨著甾醇單體分離技術(shù)的提高，部分單體如β-谷甾醇已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，相應(yīng)谷甾醇酯的合成技術(shù)也得到不斷發(fā)展。

然而，甾醇酯的微生物合成最大瓶頸在于酶的高效利用，而這又與酶的存在形式和反應(yīng)體系息息相關(guān)，因此最新研究集中在采用固定化酶，或選擇離子液體、超臨界流體等新體系[44-45]。

3 結(jié)論

甾體類化合物在食品、保健品和藥品領(lǐng)域有著舉足輕重的作用，按用途主要分為甾體類藥物和甾體類功能食品。其中甾體類藥物已是僅次于抗生素的第二大類用藥；而甾體類功能食品以甾醇酯為代表，近年來(lái)在食品、保健品領(lǐng)域頗受關(guān)注。傳統(tǒng)合成甾體類化合物的方法因存在步驟繁多、污染嚴(yán)重、條件苛刻等問(wèn)題，逐漸被環(huán)保、具特異性的微生物法所取代。合成原料也從日益緊缺的植物皂素資源轉(zhuǎn)為產(chǎn)量豐富的油脂加工副產(chǎn)物甾醇。目前，以甾醇為底物用微生物法合成甾體類藥物一般只能合成至中間體AD和ADD，合成最終產(chǎn)物的技術(shù)還有待突破；而合成甾醇酯則亟需培育針對(duì)不同甾醇（或甾醇混合物）的微生物及選擇相應(yīng)的反應(yīng)體系，這是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的前提。

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