靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取與測定

胡瓊方，董建生，高文庚

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.山西瑞芝生物科技有限公司，山西運(yùn)城 044000；3.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000）

靈芝（Ganoderma lucidum）別名赤芝、丹芝，靈芝屬真菌，其作為藥用已有兩千多年歷史，在《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》中均有記載?，F(xiàn)代研究證實(shí)，靈芝中含有多種活性成分，包括多糖類、三萜類、核苷類、甾醇類、氨基酸蛋白類等，其中多糖和三萜類是靈芝藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。

靈芝三萜類化合物具有抑菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗HIV和抑制HIV-1蛋白酶活性、抗炎癥的作用[2-11]，其提取方法多種，包括回流浸提法、微波法、超聲波法、超臨界CO2提取法[12-16]，其中超聲波技術(shù)提取率高、操作簡單，適用于工廠進(jìn)行在線檢測。靈芝發(fā)酵粉以谷物為基質(zhì)發(fā)酵精制而成，產(chǎn)品中殘留的糖類物質(zhì)會影響功能性多糖測定，故探索產(chǎn)品中三萜化合物含量的測定方法，為進(jìn)一步控制靈芝發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV754N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL6M低速離心機(jī)：上海百典儀器設(shè)備有限公司；KQ-300GDV數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW100微型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

靈芝發(fā)酵粉：山西瑞芝生物科技有限公司提供，是以谷物為發(fā)酵基質(zhì)，接入靈芝液體菌種經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后精制而成。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：安徽酷耳生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照陳飛等[17]的方法，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，于470 nm～800 nm處測定吸光度，發(fā)現(xiàn)在555 nm處測得的吸光度值最高，制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=57.516X-0.011 4，R2=0.999 3。

1.2.2 靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取與測定

精確稱取樣品2.000 0 g，用95%乙醇80 mL浸泡100 min后，180 W、60℃超聲提取30 min，取出放冷，20℃下4 000 rpm離心10 min，留上清液減壓濃縮至5 mL，取1.00 mL到試管中，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.30 mL、高氯酸1.00 mL，70℃水浴25 min，冷水浴中冷卻，超聲波輔助提取靈芝三萜化合物得率的影響，采用響應(yīng)面Box-Behnken進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定最佳提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物得率的影響

不同乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物得率的影響情況見圖1。

圖1 乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

采用超聲波輔助提取靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物，提取溶劑選取乙醇，分別選擇55%、65%、75%、85%、95%和無水乙醇進(jìn)行試驗(yàn)。由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，三萜類化合物得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中95%乙醇提取得率最高。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)。乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物的提取得率是有極顯著影響（p<0.01），因此本試驗(yàn)采用95%乙醇進(jìn)行提取。

2.2 浸泡時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

浸提前期，乙醇浸泡時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響見圖2。

圖2 浸泡時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.2 Effect of soaking time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖2可以看出，當(dāng)浸泡時(shí)間為100 min時(shí)，其三萜得率最高，為0.553 6 mg/g。低于100 min，靈芝三萜得率隨著浸泡時(shí)間的延長而升高，超過100 min則會逐漸下降。經(jīng)單因素方差分析得到（p<0.01），說明不同浸泡時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物的提取得率是有極顯著影響的，因此，試驗(yàn)采用浸泡時(shí)間為100 min。

2.3 料液比對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

浸提時(shí)的料液比對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響見圖3。

圖3 料液比對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.3 Effect of liqud to liquid ratio on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖3可知，三萜得率隨料液比的增加而升高，當(dāng)料液比高于1∶40（g/mL）時(shí)，三萜得率出現(xiàn)下降趨勢，其原因可能為一定量的靈芝發(fā)酵粉中所加入提取劑過少時(shí)不利于三萜類化合物的溶出，當(dāng)加入的提取劑不斷增加時(shí)，使得三萜化合物全部溶出。通過單因素方差分析得出（p<0.01），說明不同的料液比對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物得率是有極顯著影響，當(dāng)料液比為1 ∶40（g/mL）時(shí)，三萜含量達(dá)到最高值 0.551 4 mg/g，故選擇料液比為 1 ∶40（g/mL）。

2.4 超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

不同超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜的得率有一定影響，其結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖4可知，隨著超聲功率的不斷增加，三萜得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)超聲功率為210 W時(shí)，三萜得率達(dá)到最高值0.592 9 mg/g。經(jīng)方差分析，超聲功率為210 W時(shí)三萜得率顯著高于其他水平（p<0.05），故試驗(yàn)選擇超聲功率為210 W。

2.5 超聲時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

超聲處理的時(shí)間不同，對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響不同，測定結(jié)果見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖5可以看出，隨著超聲時(shí)間的不斷增加，靈芝發(fā)酵粉三萜得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，三萜得率達(dá)到最高值，超過20 min三萜得率在逐漸下降。經(jīng)差異性顯著分析，超聲處理時(shí)間對三萜得率的影響顯著（p<0.01）故選擇提取時(shí)間為20 min。

2.6 超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

超聲處理的溫度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取也有一定的影響，其結(jié)果見圖6。

圖6 超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖6可知，靈芝發(fā)酵粉三萜得率在超聲溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大值，超過40℃時(shí)，三萜得率在明顯下降，表明在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高越有利于靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的溶出，當(dāng)溫度過高時(shí)，不利于三萜化合物的溶出，使提取得率降低。經(jīng)單因素方差分析可知（p<0.05），不同的超聲溫度下，三萜化合物的提取得率是有顯著差異的，說明超聲溫度對三萜得率是有顯著性影響的。因此超聲溫度選擇40℃。

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步考察各因素對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取得率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率作為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以靈芝發(fā)酵粉三萜得率作為響應(yīng)值，采用四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2.7.1 模擬的建立及其顯著性檢驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert軟件對表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次模擬回歸分析，以三萜得率為因變量，料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率為自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：

三萜得率＝0.58 ＋0.026A －4.717 ×10-3B －0.022C ＋0.022D＋0.036AB－0.022AC－2.750×10-4AD－0.041BC－2.750 ×10-4BD ＋0.018CD －0.086A2－0.044B2－0.063C2－0.10D2，二次多項(xiàng)回歸分析結(jié)果見表3

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，模型p＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)p=0.487 4＞0.05，表示不顯著；即該模型對本試驗(yàn)的擬合程度良好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。其中R2=0.968 5，表明自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.937 0，說明該模型能夠解釋93.70%的響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差小，可以運(yùn)用此模型對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項(xiàng) A、C、D（p＜0.01）和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2（p＜0.000 1），說明對響應(yīng)值即靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響達(dá)到極顯著水平，AB、BC（p＜0.01），說明 A（料液比）與B（超聲溫度），B（超聲溫度）與C（超聲時(shí)間）交互作用極顯著，AC（p＜0.05）說明 A（料液比）與 C（超聲時(shí)間）交互作用顯著，說明各種試驗(yàn)因子對因變量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.7.2 響應(yīng)面交互作用分析

為確定料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率及其兩兩交互作用對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取得率的影響，根據(jù)二次模擬回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線圖（圖7～圖12）。

圖7 料液比和超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.7 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖8 料液比和超聲時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.8 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖9 料液比和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.9 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。

圖10 超聲溫度和超聲時(shí)間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.10 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖11 超聲溫度和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.11 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powde

圖12 超聲時(shí)間和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.12 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

由圖7～圖12可以看出，有3個(gè)三維曲面圖為橢圓形，3個(gè)三維曲面圖為圓形，表明料液比和超聲溫度、料液比和超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間的交互作用顯著，而料液比和超聲功率、超聲溫度和超聲功率、超聲時(shí)間和超聲功率交互作用不顯著。

2.7.3 最佳提取條件確定

利用Design-Expert軟件分析，得出靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取的最佳條件為：料液比=1∶42.53（g/mL），超聲溫度為42.97℃，超聲時(shí)間為16.99 min，超聲功率212.45 W，為便于試驗(yàn)操作，調(diào)整條件為料液比=1∶42（g/mL）、超聲溫度 43 ℃、超聲時(shí)間 17 min、超聲功率210 W。重復(fù)3次驗(yàn)證，三萜類化合物的平均得率為0.612 8 mg/g。

3 結(jié)論

影響超聲波法輔助提取三萜化合物的因素較多，試驗(yàn)僅針對主要影響因素進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定浸提溶劑為95%乙醇，提前浸泡100 min，并運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶42（g/mL）、超聲溫度43℃、超聲時(shí)間17 min、超聲功率210 W，所得靈芝三萜類化合物的得率為0.612 8 mg/g。采用超聲波提取靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物，不僅為產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)提供的基礎(chǔ)，同時(shí)對活性物質(zhì)的提取提供了指導(dǎo)作用。

[1]高文庚,尚楠,樊明濤,等.靈芝發(fā)酵粉基質(zhì)優(yōu)化及其營養(yǎng)成分分析[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,16(1):88-93

[2]王明蛟,高航,剛婉嬌.靈芝化學(xué)成分分析方法的研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(5):817-819

[3]Liu RM,Zhong JJ.Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Phytomedicine,2011,18(5):349-355

[4]王曉玲,劉高強(qiáng),周國英.紫芝發(fā)酵菌體中三萜類化合物的抑菌活性研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(11):2636-2637

[5]Shwu Bin Lin,Chyi Hann Li,Shiuh Sheng Lee,et al.Triterpene-enriched extracts from Ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase C,activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest[J].Life Sciences,2003,72(21):2381-2390

[6]劉峰,李鵬,黃秀旺,等.靈芝三萜組分GLE體內(nèi)外抗腫瘤作用[J].中國新藥雜志,2012(23):2790-2793

[7]Yue QX,Xie FB,Guan SH,et al.Interaction of Ganoderma triterpenes with doxorubicin and proteomic characterization of the possible molecular targets of Ganoderma triterpenes[J].Cancer Science,2010,99(7):1461-1470

[8]劉莉瑩,王洪慶,劉超,等.樹靈芝中三萜類成分及其保肝作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2017(4):584-589

[9]劉曉珍,聶少平,李文娟,等.黑靈芝中性提取物三萜類含量測定及抗氧化作用研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(4):332-337

[10]彭珍華,韓本,趙聲蘭,等.三萜類化合物抗HIV研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,21(5):258-262

[11]Hong Huey Ko,Chi Feng Hung,Jih Pyang wang,et al.Antiinflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma Lucidum and G.tsugae[J].Phytochemistry,2008,69(1):234-239

[12]陳慧,王曉玲,劉高強(qiáng).靈芝子實(shí)體中三萜酸的提取及其穩(wěn)定性[J].食用菌學(xué)報(bào),2015,22(4):58-64

[13]蕢霄云,何晉浙,王靜,等.微波提取靈芝中三萜類化合物的研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2):89-96

[14]洪文龍,童斌,趙格.響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝子實(shí)體三萜提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā),2014(11):42-46

[15]姚松君,黃生權(quán),陳壯耀,等.超聲輔助提取靈芝三萜的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(10):1220-1223

[16]宋師花,賈曉斌,陳彥,等.超臨界CO2萃取靈芝子實(shí)體中的三萜類成分[J].中國中藥雜志,2008,33(17):2104-2107

[17]陳飛,馬閩卉,梁運(yùn)祥,等.不同品種靈芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體多糖和三萜含量的比較[J].食品科技,2011,36(9):19-22

[18]賈瑞博,趙慧,劉凱麗,等.樹舌靈芝總?cè)铺崛」に噧?yōu)化及其抗氧化作用研究[J].應(yīng)用化工,2016,45(6):1030-1035