三七皂苷通過PPARγ調(diào)控SIRT1介導(dǎo)的狼瘡腎炎小鼠脾淋巴細(xì)胞激素耐藥及脂代謝影響的研究

丁偉森徐崢吳人照童曄玲魯盈

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江省中醫(yī)藥研究院 3.浙江省立同德醫(yī)院

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫功能紊亂所導(dǎo)致的系統(tǒng)性疾病，其中狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE最常見和最嚴(yán)重的臟器損害。LN作為慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的一種，具有疾病活動(dòng)與緩解交替、病程長(zhǎng)、病情易反復(fù)及并發(fā)癥多等特點(diǎn)[1-2]。糖皮質(zhì)激素是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的控制狼瘡活動(dòng)，改善病情的一線藥物[3]，它能快速緩解急性炎癥狀態(tài)、改善腎實(shí)質(zhì)損傷，在LN緩解期治療中發(fā)揮重要作用，極大地提高了患者的近期生存率[4]。但是，長(zhǎng)期激素應(yīng)用加之慢性炎癥加劇了患者脂代謝紊亂[5-6]，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)大幅升高，嚴(yán)重威脅著患者的遠(yuǎn)期生存，尤其是激素耐藥的難治性LN患者。

LN的中醫(yī)病機(jī)中“瘀血”占有十分重要地位[7]，“瘀血”在動(dòng)脈粥樣硬化形成中同樣占據(jù)著重要地位，如在冠心病常見中醫(yī)證候要素中“瘀血”位居首位，血脂異常則是瘀血證相關(guān)危險(xiǎn)因素之一[8-9]。活血化瘀中藥可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及抗炎、抗血小板聚集等多種途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其中三七是最常被選用的藥物[10-12]。研究證明，三七主要有效成分三七皂苷（Panax notoginseng saponin，PNS）能顯著下調(diào)狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞多藥耐藥基因編碼蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達(dá)，緩解激素耐藥[13]；進(jìn)一步研究證實(shí)沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1（silent information regulation factor related enzyme 1，SIRT1）是調(diào)控 P-gp 表達(dá)的關(guān)鍵因子[14-15]。因此，深入研究活血化瘀中藥調(diào)控LN激素耐藥和改善脂代謝紊亂的機(jī)制具有重要意義。

本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，從脂代謝角度出發(fā)，選擇脂代謝調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一的過氧化物酶增殖體活化受體γ（peroxidase activated receptor gamma，PPARγ）為切入點(diǎn)，初步研究其與SIRT1的相關(guān)性，進(jìn)一步探索PNS在調(diào)控LN小鼠激素耐藥和脂代謝紊亂中的效應(yīng)以及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NZB/WF1 LN小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～24g，委托南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院從美國(guó) Jackson Laboratory進(jìn)口 [許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0008]，飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(浙)2014-0003]。飼養(yǎng)條件：溫度（21±1）℃，濕度 50%～60%，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、使用、標(biāo)本處置和操作均按照3R原則給予人道主義關(guān)懷。動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后進(jìn)行尿液代謝檢測(cè)，測(cè)定24h尿蛋白含量。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：20161015），注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉購(gòu)于輝瑞制藥有限公司（40mg/支，批號(hào)：20160904），PNS（血塞通注射液）購(gòu)于廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司（批號(hào)：20160707），PPARγ siRNA和 PPARγ慢病毒質(zhì)粒均委托吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）合成和制備（批號(hào)：20161128、20170727），RNA提取試劑盒、Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量RT-PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)于TAKARA寶生物工程有限公司（批號(hào)：20170325、20170228、20170304、20170214），兔抗小鼠PPARγ及SIRT1抗體（一抗）、兔抗小鼠三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（adenosine triphosphate binding cassette transporter A1，ABCA1）流式檢測(cè)抗體、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG多克隆二抗均購(gòu) 于 Abcam 公 司 （ 批 號(hào) ：20170207、20170218、20170910、20170215），細(xì)胞胞質(zhì)蛋白和核蛋白提取試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：20170211），Cholesterol/Cholesteryl Ester Assay 試 劑盒購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：20170618）。流式細(xì)胞儀購(gòu)于Beckman Coulter公司，Roche 480Ⅱ型RT-PCR儀為Roche公司產(chǎn)品，F(xiàn)lour Chem E高靈敏化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)為ProteinSimple公司產(chǎn)品，Biotek Epoch 2酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯騰公司，Nikon TS100倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞模型制備 在生物安全柜中，采用密度梯度法分離NZB/WF1小鼠脾淋巴細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)體系為1mL，細(xì)胞濃度106個(gè)/mL。除對(duì)照組外，各孔均加入終濃度2μg·mL-1的甲基強(qiáng)的松龍，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、24、72h觀察細(xì)胞形態(tài)變化，72h后收集細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)，Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)。參考文獻(xiàn)[14-16]的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)中以SIRT1蛋白表達(dá)增高表示NZB/WF1小鼠脾淋巴細(xì)胞激素耐藥誘導(dǎo)成功。

1.3.2 siRNA和慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)產(chǎn)品試劑盒及說明書進(jìn)行操作。PPARγ序列：上游：5'-GCAAGAGAUCACAGAGUAUTT-3'， 下 游 ：5'-AUACU－CUGUGAUCUCUUGCTT-3'。慢病毒滴度：5×108TU·mL-1。轉(zhuǎn)染72h后檢測(cè)，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值=10時(shí)說明已達(dá)到良好的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率。

1.3.3 分組及干預(yù) 將小劑量甲基強(qiáng)的松龍誘導(dǎo)產(chǎn)生激素耐藥的淋巴細(xì)胞，分為模型組（LN小鼠脾淋巴細(xì)胞激素耐藥組）、PPARγ siRNA+PNS組、PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和PNS組，并將未誘導(dǎo)激素耐藥的NZB/WF1小鼠脾淋巴細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。siRNA終濃度2μg·mL-1。慢病毒質(zhì)粒按照MOI=10，即病毒數(shù):細(xì)胞數(shù)=10:1加入每孔。PNS終濃度根據(jù)前期研究確定為200μg·mL-1[14]。培養(yǎng)72h后，提取各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.4 檢測(cè)方法

1.3.4.1 Real-time PCR法檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞PPARγ和SIRT1 mRNA表達(dá) 參照Trizol抽提試劑盒及說明書，提取干預(yù)72h后的脾淋巴細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物擴(kuò)增設(shè)計(jì)見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。PCR 反應(yīng)條件：95℃30min，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，60℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，1 個(gè)循環(huán)。將各組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)用Roche 480Ⅱ PCR儀進(jìn)行反應(yīng)后得出Mean CT值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4.2 Western blot檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞PPARγ和SIRT1蛋白表達(dá) 按照試劑盒說明書分別提取胞質(zhì)蛋白和核蛋白。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳（300V，40min），300mA 轉(zhuǎn)膜 2h，放入 5%脫脂牛奶中室溫震蕩封閉1h；一抗4℃過夜。TBST反復(fù)洗膜后，將膜與二抗進(jìn)行孵育，室溫?fù)u床震蕩1h，TBST洗膜后ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各帶吸光度(A)值作定量分析。

表1 引物序列Fig.1 Primer sequence

1.3.4.3 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞膽固醇酯的含量 將培養(yǎng)72h后的各組細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗1～2次，Nonidet P40處理細(xì)胞，離心后轉(zhuǎn)移橙色層液相至新的離心管，置于50℃烘箱中30min，每孔加入200μL Cholesterol Assay Buffer，震蕩溶解，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h后，熒光分光分度計(jì)按照Ex/Em=535/585nm，測(cè)定OD值。

1.3.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá) 提取培養(yǎng)72h后的各組細(xì)胞，以100μL含1%疊氮化鈉和10%胎牛血清的PBS重懸，加入兔抗小鼠ABCA1抗體（一抗），室溫孵育30min。離心后PBS洗3次。用100μL含5%牛血清白蛋白的PBS重懸，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體（二抗），室溫避光孵育30min。離心后PBS洗3次。PBS 500μL重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用方差分析，行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞PPARγ和SIRT1 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組PPARγ mRNA表達(dá)降低，SIRT1 mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05）；與模型組比較，PPARγ siRNA+PNS組、PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和PNS組PPARγ mRNA表達(dá)均上調(diào)，而SIRT1 mRNA表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05），其中PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與PNS組比較，SIRT1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞PPARγ和SIRT1蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組中PPARγ蛋白表達(dá)降低，SIRT1蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與模型組比較，PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、PNS組PPARγ蛋白表達(dá)均增高（P＜0.05），而PPARγ siRNA+PNS組PPARγ蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組比較，PPARγ siR-NA+PNS組、PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和PNS組中SIRT1蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。見圖1、表3。2.3 各組LN小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量比較與對(duì)照組比較，模型組和PPARγ siRNA+PNS組細(xì)胞

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PPARγ及SIRT1 mRNA表達(dá)（±s，n=3）Tab.2 Expression of PPAR gamma and SIRT1 mRNA in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PPARγ及SIRT1 mRNA表達(dá)（±s，n=3）Tab.2 Expression of PPAR gamma and SIRT1 mRNA in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 PPARγ siRNA+PNS 組比較，△P＜0.05；與 PPARγ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

2.1584±0.0024*0.1037±0.0061*#0.0097±0.0033*#△0.0074±0.0092*#△1±0.0064組別 n mRNA相對(duì)表達(dá)量PPARγ SIRT1模型組PPARγ siRNA+PNS組PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PNS組對(duì)照組3 3 3 3 3 0.0083±0.0042*0.0197±0.0085*#2.9281±0.0035*#△1.7654±0.0071*#△▲1±0.0053

圖1 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PPARγ及SIRT1蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group

表3 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PPARγ及SIRT1蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

表3 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PPARγ及SIRT1蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 PPARγ siRNA+PNS 組比較，△P＜0.05；與 PPARγ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

組別 n蛋白相對(duì)表達(dá)PPARγ/β-Actin SIRT1/β-Actin 0.99±0.03*0.87±0.02*#0.42±0.09*#△0.33±0.06*#△▲0.52±0.05模型組PPARγ siRNA+PNS組PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PNS組對(duì)照組3 3 3 3 3 0.24±0.07*0.22±0.08*0.76±0.06*#△0.75±0.04*#△0.32±0.06

內(nèi)膽固醇酯含量降低（P＜0.05）；而PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、PNS組細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、PNS組細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量均增高（P＜0.05）；但PPARγ siRNA+PNS組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 Cholesteryl ester expression in spleen lymphocytes of mice in each group（±s，n=3)

表4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 Cholesteryl ester expression in spleen lymphocytes of mice in each group（±s，n=3)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 PPARγ siRNA+PNS 組比較，△P＜0.05；與 PPARγ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

組別OD值0.762±0.071*0.824±0.045*2.347±0.032*#△2.036±0.087*#△▲1.413±0.035模型組PPARγ siRNA+PNS組PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PNS組對(duì)照組

2.4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，模型組、PPARγ siRNA+PNS組ABCA1蛋白表達(dá)增高，PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和PNS組ABCA1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，PPARγ siRNA+PNS組、PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、PNS組中ABCA1蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），其中PNS組ABCA1蛋白表達(dá)下降程度最高（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

三七是五加科多年生草本植物，具有止血、散瘀、定痛等作用，為活血化瘀，止血生新的要藥。作為活血化瘀藥的代表，它既能化瘀又能補(bǔ)虛，正符合SLE本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)，也是臨床上治療LN的常用藥。PNS是三七主要有效活性成分之一。既往研究表明，PNS具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用[17]。藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，其具有抗血栓形成、抗缺血性損傷、抗血小板聚集、擴(kuò)張小血管、改善腎血管微循環(huán)、增加腎血流量等作用[18]。本研究中證實(shí)PNS能夠降低激素耐藥LN小鼠脾淋巴細(xì)胞中SIRT1表達(dá)，結(jié)合前期研究結(jié)果[14-16]，再次證實(shí)PNS通過SIRT1/叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead transcription factor 1，F(xiàn)oxO1）/多藥耐藥-1（multidrug resistance-1，MDR-1）/P-gp 信號(hào)通路降低 SIRT1 和P-gp表達(dá)，逆轉(zhuǎn)LN鼠脾淋巴細(xì)胞激素耐藥。

PPARγ是一類配體依賴的核受體轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是重要的激素受體，主要位于脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中，在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中也有分布[19]。研究證實(shí)，PPARγ是細(xì)胞脂代謝調(diào)控的關(guān)鍵靶標(biāo)之一，主要參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成[20-21]。SIRT1作為一種輔酶Ⅰ依賴性的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，其底物就包括PPARγ[22]。在代謝性疾病領(lǐng)域的研究已證實(shí)PPARγ和SIRT1之間關(guān)系密切[23-24]。SIRT1通過對(duì)PPARγ的作用，促進(jìn)“褐變”的白色脂肪組織分化和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成[25]。在對(duì)慢性疾病防御機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制SIRT1能夠減輕成人高氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[26]。本研究采用PNS和慢病毒質(zhì)粒干預(yù)PPARγ，結(jié)果顯示PNS既能提高激素耐藥LN小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)PPARγ表達(dá)，也能降低SIRT1表達(dá)，且對(duì)SIRT1表達(dá)的調(diào)控與PPARγ相關(guān)，一方面改善了LN淋巴細(xì)胞的激素耐藥，另一方面調(diào)控了由PPARγ介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂代謝。

圖2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中ABCA1蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of ABCA1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group

研究發(fā)現(xiàn)，LN患者外周血總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平較正常人群和不伴L(zhǎng)N的患者增高[27]。眾所周知，長(zhǎng)療程使用糖皮質(zhì)激素可致LN患者外周血血脂水平升高。課題組在前項(xiàng)研究中也觀察到，LN小鼠激素耐藥模型外周血甘油三酯水平明顯升高。研究證實(shí)，淋巴細(xì)胞內(nèi)存在脂質(zhì)代謝過程，而且細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)調(diào)控水平與血清有所不同[28-29]。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激素耐藥LN小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)存在脂代謝紊亂，PNS可以提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量，改善脂代謝紊亂，維持正常脂質(zhì)水平。ABCA1是一類依賴三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的轉(zhuǎn)運(yùn)體膜蛋白。作為參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的關(guān)鍵蛋白，ABCA1通過修飾細(xì)胞膜脂筏或直接激活信號(hào)通路介導(dǎo)脂質(zhì)流出，發(fā)揮抗炎功能[30]，它能結(jié)合細(xì)胞表面貧脂或無(wú)脂的載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)，促進(jìn)高密度脂蛋白生成，啟動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）過程，對(duì)防止動(dòng)脈粥樣硬化形成具有重要意義[31-32]。本研究通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量和ABCA1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示激素耐藥LN小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯合成減少，含量降低，細(xì)胞內(nèi)脂代謝出現(xiàn)紊亂；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)RCT過程異常激活，膽固醇外流增加。PNS干預(yù)能降低耐藥小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)ABCA1蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量，結(jié)合前文所述PNS能提高耐藥模型細(xì)胞內(nèi)PPARγ表達(dá)，揭示PNS可能通過多個(gè)作用途徑改善細(xì)胞內(nèi)脂代謝紊亂，維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平。

綜上所述，激素耐藥LN小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)存在脂代謝紊亂，PNS能通過上調(diào)PPARγ表達(dá)，降低SIRT1表達(dá)；并抑制ABCA1蛋白高表達(dá)和提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量，起到既逆轉(zhuǎn)激素耐藥又改善脂質(zhì)代謝紊亂的雙重效應(yīng)。本研究結(jié)果表明以三七為代表的活血化瘀類中藥存在多方面的作用，為臨床運(yùn)用中藥逆轉(zhuǎn)LN激素耐藥，提高療效，防治動(dòng)脈粥樣硬化，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后及生存質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

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