苦蘵內(nèi)酯J降解STAT3蛋白誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

傅宇斐陳喆戴春艷張光霽

1.浙江省中醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中約80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），患者5年生存率很低。傳統(tǒng)的治療包括手術(shù)、放療、化療，但均缺乏特異性。靶向治療的興起大大改善了肺癌患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量，其中最常用的靶向治療藥物為表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。然而絕大多數(shù)患者靶向治療后疾病再次出現(xiàn)進(jìn)展，且表現(xiàn)出對(duì)EGFR-TKI的獲得性耐藥，其中約60%的耐藥患者存在EGFR T790M繼發(fā)性突變[1]。EGFR繼發(fā)性突變是導(dǎo)致EGFRTKI治療耐藥的直接原因，有研究報(bào)道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是EGFR突變的重要調(diào)節(jié)分子，STAT3活化是耐藥性產(chǎn)生的重要機(jī)制[2-3]。因此，尋找新型靶向治療藥物是治療獲得性耐藥NSCLC的關(guān)鍵，而抑制STAT3的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制的突破點(diǎn)。

臨床實(shí)踐證明，中醫(yī)藥治療肺癌具有穩(wěn)定病灶、延長(zhǎng)生存期、提高生存質(zhì)量等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)[4]。中藥燈籠草又名毛苦蘵，味苦，性涼，具有清熱解毒之功[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,毛苦蘵提取物和活性成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[6-8]。筆者前期系統(tǒng)開(kāi)展了毛苦蘵活性成分的分離鑒定和抗腫瘤活性的研究，發(fā)現(xiàn)其活性成分酸漿苦素A能夠抑制NSCLC細(xì)胞賈納斯激酶（Janus kinase，JAK）/STAT3信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡[9]。多項(xiàng)研究表明，STAT3信號(hào)通路的激活能顯著抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，而STAT3抑制劑則能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-12]?？嗵u內(nèi)酯J是從毛苦蘵中提取的新型活性化合物之一，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，其抗腫瘤機(jī)制尚未見(jiàn)于報(bào)道。筆者研究發(fā)現(xiàn)，苦蘵內(nèi)酯J具有極強(qiáng)的抑制STAT3活化的能力，同時(shí)能夠下調(diào)STAT3總蛋白的表達(dá)水平。本文進(jìn)一步探討苦蘵內(nèi)酯J對(duì)EGFR T790M突變肺腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，為拓寬其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 苦蘵內(nèi)酯J結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of Physagulin J from Physalis angulata L

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 EGFR T790M繼發(fā)突變的肺腺癌細(xì)胞株H1975細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（上海）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自 Gibco公司（批號(hào)：1616964、1535888）；CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)（批號(hào)：KM671）；Annexin V-PI流式凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD bioscience公司（批號(hào)：6179925）；STAT3、p-STAT3-Tyr、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP一抗均購(gòu)自CST公司（批號(hào)：8、31、45、11、9）；β-actin 一抗購(gòu)自華安生物公司（批號(hào)：HJ1117）；Ub一抗購(gòu)自Santa Cruz公司（批號(hào)：L3013）；Western blot用二抗購(gòu)自聯(lián)科生物公司（批號(hào)：6223417、6223515）；免疫熒光用二抗購(gòu)自Thermo Fisher公司（批號(hào)：1562298、1504518）；封片用DAPI購(gòu)自 Sourthern biotech公司（批號(hào)：L3113-W893）；苦蘵內(nèi)酯J提取自安徽收集的毛苦蘵植物，提取及鑒定均由浙江大學(xué)藥學(xué)院馬忠俊實(shí)驗(yàn)室完成，苦蘵內(nèi)酯J粉末以DMSO溶解提取，初始濃度為20mmol·L-1。

1.1.2 主要儀器 sp8型激光共聚焦熒光顯微鏡（Leica公司）；BX53型倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）；CantoII流式細(xì)胞分析儀（BD公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)檢測(cè)儀（Thermo公司）；7900型實(shí)時(shí)熒光定量QPCR儀（Applied Biosystems）；Nano Drop微量紫外分光光度計(jì)（Thermo公司）；蛋白凝膠電泳儀（Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H1975細(xì)胞培養(yǎng)方法及實(shí)驗(yàn)分組 H1975細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)血清計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照各實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置濃度梯度組或時(shí)間梯度組，并將細(xì)胞平均分組，藥物的處理濃度及時(shí)間設(shè)置參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將H1975細(xì)胞懸液100μL混勻加入 96孔板中，3×104個(gè)/孔，分別設(shè)置24h實(shí)驗(yàn)組和48h實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)濃度一個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行孔，細(xì)胞貼壁后加入含有不同濃度苦蘵內(nèi)酯J的完全培養(yǎng)基。對(duì)照組中不加入苦蘵內(nèi)酯J，其余各組分別加入 5、15、20、25、30、40μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J，培養(yǎng)24h及48h后分別加入10μL CCK-8反應(yīng)液，多加一組空白組（100μL無(wú)細(xì)胞完全培養(yǎng)基+10μL CCK-8反應(yīng)液），37℃放置1h后，測(cè)定450nm處的光密度值后計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（各苦蘵內(nèi)酯J濃度組光密度值-空白組光密度值）/（對(duì)照組光密度值-空白組光密度值）×100%。

1.2.3 Annexin V-PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1975細(xì)胞，對(duì)照組中不加入苦蘵內(nèi)酯J，其余各組細(xì)胞經(jīng) 5、10、15、20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J處理24h后，使用不含EDTA的胰酶消化后離心收集，按照BD提供的說(shuō)明書(shū)在每個(gè)離心管中加入250μL Binding buffer懸浮細(xì)胞；再分別加入Annexin V（FITC）-PI反應(yīng)液各2.5μL，避光孵育10min后上機(jī)檢測(cè)記錄細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、STAT3及Ub的表達(dá) 同上收集細(xì)胞，對(duì)照組中不加入苦蘵內(nèi)酯J，其余各組細(xì)胞經(jīng) 5、10、15、20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J處理 4h，或 20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J處理 0、0.5、1、2、4h。收集各組細(xì)胞，加入含有1%PMSF的RAPA裂解液冰上裂解40min，12 000r/min離心10min后取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20μg蛋白上樣，調(diào)整樣品至相同濃度，與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸變性5min。經(jīng)5%的濃縮膠和10%的分離膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1h，將膜轉(zhuǎn)入含一抗（β-actin稀釋倍數(shù) 1:3 000，cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP、STAT3、p-STAT3-Tyr稀釋倍數(shù)均為1:1 000，一抗 Ub稀釋倍數(shù) 1:500）的 TBST中，4℃孵育過(guò)夜。TBST室溫洗膜4次，每次10min，將膜轉(zhuǎn)入含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗的TBST中（二抗稀釋倍數(shù)1:5 000），室溫孵育2h，TBST室溫洗膜3次，每次10min。ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光1min，掃描圖像。Image J軟件分析條帶灰度值，以相對(duì)灰度值（目的條帶灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值）表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)STAT3 mRNA表達(dá)20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J作用H1975細(xì)胞4h后，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，采用Trizol法提取各組細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度及濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 10s、60℃退火30s，72℃延伸5s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。計(jì)算采用Ratio=2-ΔΔCT法，ΔCT1=對(duì)照組目的基因 CT 值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因 CT 值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式 2-ΔΔCT計(jì)算，即得到實(shí)驗(yàn)組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J作用不同時(shí)間對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度增加及處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用加強(qiáng)。見(jiàn)表2。

2.2 苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J處理H1975細(xì)胞24h后，隨著苦蘵內(nèi)酯J濃度增加，H1975細(xì)胞的凋亡率隨之增加。5μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率為 9.3%，10μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率為21.2%，15μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率為37.3%，20μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率為51.1%。見(jiàn)圖2。

表2 苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞存活百分率（±s，%）Tab.2 Cell viability of Physagulin J-treated H1975 cells(±s,%)

表2 苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞存活百分率（±s，%）Tab.2 Cell viability of Physagulin J-treated H1975 cells(±s,%)

注：與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)（0μmol·L-1）比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與相同濃度作用 24h 比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。Note:Compared with control group(0μmol·L-1)at the same time,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001;compared with the same concentration group of 24h,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.

苦蘵內(nèi)酯 J濃度（μmol·L-1） 24h 48h 100 91.2017±6.5249 69.1444±4.8698*#44.1509±3.9826**##35.9734±4.0257*###27.0215±2.8945**###19.2037±1.2512***###0 5 1 5 20 25 30 40 100 96.1712±6.7562 81.1414±7.9127 65.9036±6.5694*58.6400±4.5123*54.0214±2.9825**40.5370±2.5843**

圖2 苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 FACS analysis of Physagulin J induced H1975 cells apoptosis

2.3 苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 苦蘵內(nèi)酯J處理24h后，凋亡相關(guān)剪切體蛋白cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和cleaved-PARP的表達(dá)顯著上升，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot analysis of apoptosis related proteins

表3 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.3 Relative mean gray value of apoptosis markers in dose-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

表3 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.3 Relative mean gray value of apoptosis markers in dose-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

凋亡相關(guān)蛋白 5μmol·L-1組 10μmol·L-1組 15μmol·L-1組cleaved-caspase 9 cleaved-caspase 3 cleaved-PARP 1±0.0657 1±0.0488 1±0.0076 1.09±0.1099 1.43±0.1286 1.90±0.1563*1.76±0.1877*4.23±0.7944**2.43±0.6672**1.83±0.2265*9.11±1.2931**3.91±1.1909**20μmol·L-1組 對(duì)照組1.67±0.2753*6.84±1.9470*3.97±0.6589***

2.4 苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞STAT3及其磷酸化水平的影響 根據(jù)既往研究結(jié)果，藥物抑制STAT3磷酸化在4h后發(fā)揮顯著作用[9]，本研究選擇了4h作為苦蘵內(nèi)酯 J的作用時(shí)間。5、10、15、20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J處理H1975細(xì)胞4h后，能夠顯著抑制STAT3總蛋白及 STAT3-Tyr表達(dá)（P＜0.01，P＜0.001）。見(jiàn)圖4、表4。20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J處理 H1975 細(xì)胞 0、0.5、1、2、4h 后，STAT3 總蛋白及 STAT3-Tyr表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。見(jiàn)圖5、表5。

圖4 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響Fig.4 The effect on STAT3 and its phosphorylation level after concentration course of Physagulin J

表4 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞STAT3及p-STAT3-Tyr平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.4 Relative mean gray value of STAT3 and p-STAT3-Tyr in dose-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

表4 不同濃度苦蘵內(nèi)酯J處理后H1975細(xì)胞STAT3及p-STAT3-Tyr平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.4 Relative mean gray value of STAT3 and p-STAT3-Tyr in dose-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。Note:Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.

目的蛋白 5μmol·L-1組 10μmol·L-1組 15μmol·L-1組p-STAT3-Tyr STAT3 1±0.0218 1±0.0154 0.54±0.0476***0.86±0.1276 0.34±0.0298***0.68±0.0751**0.2±0.0017***0.54±0.0492***20μmol·L-1組 對(duì)照組0.17±0.0216***0.39±0.0581***

圖5 20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J處理不同時(shí)間對(duì)STAT3表達(dá)及其磷酸化水平的影響Fig.5 The effect on STAT3 and its phosphorylation level after treated for different time with 20μmol·L-1Physagulin J

表5 苦蘵內(nèi)酯J處理不同時(shí)間后STAT3及p-STAT3-Tyr平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.5 Relative mean gray value of STAT3 and p-STAT3-Tyr in time-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

表5 苦蘵內(nèi)酯J處理不同時(shí)間后STAT3及p-STAT3-Tyr平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.5 Relative mean gray value of STAT3 and p-STAT3-Tyr in time-dependently Physagulin J-treated H1975 cells(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

目的蛋白 0.5h組 1h組 2h組p-STAT3-Tyr STAT3 1±0.0106 1±0.0059 0.76±0.0385*0.82±0.1016 0.75±0.0144**0.77±0.0813**0.57±0.0063***0.64±0.0182***4h組 對(duì)照組0.26±0.0112***0.49±0.0381***

2.5 蛋白酶體抑制劑與苦蘵內(nèi)酯J共處理對(duì)STAT3蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)前文2.2及2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J處理24h后H1975細(xì)胞凋亡率為21.2%，故選擇該濃度用于本實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果提示，10μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯 J處理 H1975細(xì)胞4h后STAT3總蛋白顯著低于對(duì)照組（P＜0.001），而10μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J預(yù)處理H1975細(xì)胞2h后，再加入20μmol·L-1蛋白酶體抑制劑 MG132共處理H1975細(xì)胞4h，STAT3蛋白表達(dá)水平升高，顯著高于苦蘵內(nèi)酯J處理組（P＜0.01），與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖6、表6。

圖6 MG132與苦蘵內(nèi)酯J共處理對(duì)STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of MG132 and Physagulin J co-culture on STAT3 protein expression

表6 MG132與苦蘵內(nèi)酯J處理后STAT3及Ub蛋白平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.6 Relative mean gray value of STAT3 and Ub in MG132 and Physagulin J treated H1975 cells(±s)

表6 MG132與苦蘵內(nèi)酯J處理后STAT3及Ub蛋白平均相對(duì)灰度值（±s）Tab.6 Relative mean gray value of STAT3 and Ub in MG132 and Physagulin J treated H1975 cells(±s)

注：與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與苦蘵內(nèi)酯 J組比較，ΔΔP＜0.01。Note：Compared with control group,***P＜0.001;compared with Physagulin J group, ΔΔP＜0.01.

1±0.0527 1±0.0218目的蛋白 MG132組 苦蘵內(nèi)酯J組STAT3 Ub 1.106±0.1423 3.6492±0.2955***0.5329±0.0429***0.9527±0.3023 MG132與苦蘵內(nèi)酯J聯(lián)合組 對(duì)照組1.2154±0.3163ΔΔ 3.2619±0.5327ΔΔ

2.6 苦蘵內(nèi)酯J對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)STAT3 mRNA水平的影響 依據(jù)前面實(shí)驗(yàn)，選擇20μmol·L-1為苦蘵內(nèi)酯J作用濃度。20μmol·L-1苦蘵內(nèi)酯J作用H1975細(xì)胞4h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，苦蘵內(nèi)酯J作用后，STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表7。

表7 苦蘵內(nèi)酯J處理后STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab.7 Relative STAT3 mRNA level of Physagulin J-treated H1975 cells（±s）

表7 苦蘵內(nèi)酯J處理后STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab.7 Relative STAT3 mRNA level of Physagulin J-treated H1975 cells（±s）

STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量苦蘵內(nèi)酯J組對(duì)照組組別1.0568±0.1098 1±0.0876

3 討論

中醫(yī)藥治療腫瘤具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和方法，隨著中醫(yī)對(duì)肺癌認(rèn)識(shí)的不斷加深，中醫(yī)藥在NSCLC的治療中逐步得到認(rèn)可，加之療效顯著，無(wú)明顯毒副作用，中醫(yī)藥治療NSCLC具有獨(dú)特的臨床作用與地位[4]，尤其是在晚期NSCLC治療中，中醫(yī)藥的作用越來(lái)越受到關(guān)注。中醫(yī)學(xué)將肺癌歸于“肺壅”“肺積”“息賁”等范疇，痰濕內(nèi)蘊(yùn)、痰毒瘀結(jié)是其基本病理。肺癌屬“百病皆由痰作祟”，由于正氣內(nèi)虛，邪毒趁虛而入，邪毒侵肺，肺失宣降，津液輸布不暢而致痰，痰凝氣滯阻滯脈絡(luò)，久之痰毒瘀結(jié)而成腫塊。因此，利用中藥去除癌毒、化痰、清熱是治療肺癌的有效手段。我國(guó)的藥用植物種質(zhì)資源豐富，如果能將中藥中抗腫瘤有效成分篩選分離出來(lái)，其具有產(chǎn)量大，加工方便的優(yōu)勢(shì)，且可顯著降低腫瘤患者治療成本。明確其抗腫瘤作用及機(jī)制，對(duì)于抗腫瘤藥物的研制開(kāi)發(fā)以及腫瘤治療具有重要的意義。

毛苦蘵又名蘵、小苦耽、掛金燈或燈籠草，屬茄科酸漿屬，其味苦、酸，性寒，具有解毒、消腫、清熱、化痰利咽等功效，且在抗癌方面具有顯著療效，已在臨床廣泛使用于中藥配方中[8]。Kang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，毛苦蘵提取物能夠誘導(dǎo)激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）/活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）通路使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，毛苦蘵提取物對(duì)前列腺癌和腎癌細(xì)胞都有細(xì)胞毒活性。

多項(xiàng)研究報(bào)道，NSCLC細(xì)胞STAT3通路的激活是EGFR突變產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素[6-7]。在22%～65%的NSCLC中，STAT3通路持續(xù)激活[14-16]，因此STAT3的高表達(dá)以及高度活化可能是導(dǎo)致NSCLC晚期化療效果差、患者生存率低的關(guān)鍵因素。已經(jīng)有報(bào)道證明JAK/STAT3抑制劑能夠抑制STAT3的活化，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為抗腫瘤和抗血管生成的效應(yīng)，并且已經(jīng)有JAK/STAT3抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[17-19]。但是，STAT3的直接抑制劑很少，大多為JAK抑制劑，且尚處于臨床試驗(yàn)階段，副作用尚不明確。因此從中草藥中開(kāi)發(fā)有效的STAT3抑制劑為EGFR-TKI耐藥的NSCLC治療提供了新思路和新手段。

本研究證實(shí)，苦蘵內(nèi)酯J對(duì)EGFR T790M繼發(fā)突變細(xì)胞H1975有明顯的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)苦蘵內(nèi)酯J能夠抑制STAT3磷酸化和STAT3總蛋白表達(dá)，而對(duì)STAT3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響。蛋白酶體抑制劑MG132抑制了泛素化蛋白的降解，總蛋白中所有攜帶Ub泛素鏈的蛋白聚集。Western blot證實(shí)，苦蘵內(nèi)酯J處理后，STAT3發(fā)生泛素化而被蛋白酶體識(shí)別后被降解，加入蛋白酶體抑制劑MG132后，STAT3蛋白表達(dá)回復(fù)至對(duì)照組水平。因此，蛋白酶體抑制劑實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，苦蘵內(nèi)酯J促進(jìn)STAT3蛋白泛素化及降解，進(jìn)一步導(dǎo)致其磷酸化水平降低，從而引起細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。因此，苦蘵內(nèi)酯J是一種新型、有效的STAT3靶向抑制劑，通過(guò)抑制STAT3總蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步深入闡釋了苦蘵內(nèi)酯J抗腫瘤的部分作用機(jī)制，為尋找中藥治療耐藥NSCLC的作用靶點(diǎn)研究提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。筆者將進(jìn)一步進(jìn)行苦蘵內(nèi)酯J與EGFR-TKI的聯(lián)合研究，為解決EGFR-TKI耐藥及中西醫(yī)聯(lián)合治療奠定基礎(chǔ)。

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