海地瓜多糖和多肽提取純化工藝及抗氧化活性

陳發(fā)河，李 真，吳光斌

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

海地瓜(Acaudinamolpadioides)，屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)芋參目(Molpadioides)[1]。作為我國(guó)大宗低值海參品種，海地瓜廣泛分布在我國(guó)山東、福建和廣東沿海，食用品質(zhì)較差。相關(guān)研究表明[2-6]，海地瓜體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、皂苷、必需氨基酸、維生素和微量元素等活性組分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。由于海地瓜屬低值海參，口感較差，食用價(jià)值較低，因此，研究其中的功效成分的分離提取工藝技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)低值海參資源高值化利用的有效途徑。

海參獨(dú)特的自溶現(xiàn)象，給運(yùn)輸與貯藏帶來(lái)極大不便。目前，海參加工產(chǎn)品主要有海參干品、海參冷凍制品、即食海參等傳統(tǒng)海參產(chǎn)品以及海參口服液、膠囊制劑等深加工功能性海參制品[7-8]。海參多糖是海參體壁的重要組成物質(zhì)，主要包括海參硫酸軟骨素及海參巖藻聚糖硫酸酯2種組分[9-10]，已證實(shí)海參多糖具有增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、抗凝血、降血脂和預(yù)防組織老化等多種特殊功效[11-12]。海參體壁富含蛋白質(zhì)，干品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)70%以上，是制備生物活性肽非常理想的原料[13-15]。海參活性肽的生物活性研究主要集中在降血壓、抗疲勞、提高免疫力、抗菌抗氧化等方面[16-18]。運(yùn)用海參自溶和外源酶酶解相結(jié)合的技術(shù)可有效制備海參多糖和活性多肽[13]。本文以海地瓜為原料，采用酶解和超濾相結(jié)合的方法，研究了聯(lián)合制備不同分子質(zhì)量段海地瓜多糖和多肽的工藝，并對(duì)不同分子質(zhì)量段海地瓜多糖及多肽的體外抗氧化活性進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海地瓜干品購(gòu)自廈門中埔水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)前洗凈體表與體內(nèi)的泥沙，去除內(nèi)臟，水發(fā)后剪成小塊，于45 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，制成海地瓜干粉，裝入自封袋，貯存于干燥器中備用。

木瓜蛋白酶(2×105U/g)，中性蛋白酶(2×105U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶(2.5×105U/g)，北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白、D-氨基葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、Tris-base，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Q-Sepharose-Fast-Flow凝膠(分裝進(jìn)口)，美國(guó)Pharmacia；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary50紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Varian公司；TH-300A梯度混合儀、BT-100恒流泵、DBS-100部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；層析柱(1.5 cm×40 cm、1.5 cm×70 cm)，上海方畦儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ 循環(huán)水多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；超濾膜(UP010、US100、UV200、UP010、UP005、NP010) ，邁納德膜技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 總糖及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[19]；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Folin-酚法[20]。

1.3.3 酶法提取海地瓜多糖和多肽

1.3.3.1 蛋白酶的篩選

選用胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，根據(jù)酶制劑說(shuō)明書提供的最佳酶解條件設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以酶解液中總糖含量和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白酶的使用量。實(shí)驗(yàn)中均取10 g海參粉，料液比(m/V)為1∶40，用1 mol/L的鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，加酶量為2%，在電熱恒溫振蕩水槽中酶解4 h后，置于100 ℃沸水浴滅酶5 min，冷卻后離心(4000 r/min，15 min)，取上清液定容于100 mL，分別用苯酚-硫酸法和Folin-酚法測(cè)A490和A640，計(jì)算酶解液中總糖和蛋白質(zhì)含量。選用酶解液中蛋白質(zhì)含量最高的蛋白酶A對(duì)原料液進(jìn)行一次酶解，總糖含量最高的蛋白酶B對(duì)一次酶解沉淀及超濾截留液進(jìn)行二次酶解。

1.3.3.2 酶解條件的優(yōu)化

對(duì)實(shí)驗(yàn)用酶進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察酶解時(shí)間、加酶量、酶解pH值和酶解溫度這4個(gè)因素。每個(gè)因素選取不同的水平，均做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算酶解液中的總糖含量或蛋白質(zhì)含量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素在最優(yōu)范圍內(nèi)選取3個(gè)水平，利用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)每種實(shí)驗(yàn)用酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3.3 雙酶體系復(fù)合酶解試驗(yàn)

提取海參多糖的關(guān)鍵在于破壞糖鏈與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)結(jié)合，即肽鍵。由于蛋白酶對(duì)肽鏈斷裂作用具有專一性，一種酶只能水解固定的幾種氨基酸殘基，使其多糖提取率受到限制。因此，以單酶最佳酶解工藝為基礎(chǔ)，選用雙酶體系復(fù)合酶解，確定最佳酶解方案。

1.3.4 超濾條件的優(yōu)化

超濾過(guò)程中以不同的操作壓力、料液濃度和操作溫度為考察因素，以膜通量和膜效能為衡量指標(biāo)[21]，確定最佳超濾條件。膜通量以單位時(shí)間通過(guò)單位膜面積透過(guò)液的體積來(lái)表示，具體公式為：膜通量(LMH)=V/(T×S)；膜效能以單位時(shí)間通過(guò)單位膜面積透過(guò)液冷凍干燥后的質(zhì)量來(lái)表示，具體公式為：膜效能(MMH)=M/(T′×S)，其中，V為超濾透過(guò)液的體積(L)；M為超濾透過(guò)液冷凍干燥后的質(zhì)量(g)；S為平板超濾膜的表面積(m2)；T和T′為原料液通過(guò)膜表面所消耗的時(shí)間，單位分別為h和min。

1.3.5 超濾法分離分級(jí)海地瓜多肽和多糖

選用截留分子質(zhì)量為5 ku和1 ku的超濾膜依次對(duì)海地瓜多肽混合液進(jìn)行超濾分級(jí)，選用截留分子質(zhì)量為10，100和200 ku的超濾膜依次對(duì)海地瓜多糖粗提液進(jìn)行截留液超濾分級(jí)。采用截留液全循環(huán)超濾方式，當(dāng)截留液體積為原始酶解液體積的1/5時(shí)，達(dá)到超濾終點(diǎn)。依次收集5，1 ku截留液和1 ku透過(guò)液，透析除鹽并冷凍干燥得到3個(gè)海地瓜多肽組分。依次收集10，100，200 ku透過(guò)液和200 ku截留液，透析除鹽并冷凍干燥得到4個(gè)海地瓜粗多糖組分。

1.3.6 海地瓜高分子質(zhì)量粗多糖G4的離子交換柱層析法純化

參照文獻(xiàn)[22]，采用Q-Sepharose-Fast-Flow強(qiáng)陰離子交換柱對(duì)G4進(jìn)行分離純化。取適量海參粗多糖溶解、離心去沉淀后上樣，流速1 mL/min，每管收集5 mL，采用苯酚-硫酸法和波長(zhǎng)280 nm處紫外吸收法分別測(cè)定各收集管的多糖含量和蛋白質(zhì)含量，繪制洗脫峰，按多糖峰收集各含糖組分，透析法(3500 u)除鹽、旋蒸濃縮、冷凍干燥后，低溫干燥儲(chǔ)藏備用。

1.3.7 羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23-24]，反應(yīng)體系依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH =7.40，1 mol/L)、1.0 mL番紅花紅試劑(100 mg/L)、1.0 mL EDTA-Fe2+試劑(1 mmol/L)、0.5 mL各濃度樣品溶液以及1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液，混合均勻，37 ℃下保溫靜置30 min，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值，記為AS(用1.0 mL磷酸鹽緩沖液加3.5 mL蒸餾水調(diào)零)。按照相同的操作方法，以1.5 mL蒸餾水代替樣品和H2O2溶液，吸光度值記為A；以0.5 mL蒸餾水代替樣品，吸光度值記為A0，·OH清除率計(jì)算公式為：·OH清除率(%) =(AS-A0)/A×100。

1.3.8 1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[25-27]，取各濃度的樣品溶液2.0 mL和0.1 mmol/L的 DPPH·-乙醇溶液2.0 mL，充分混合均勻，在室溫下避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度值，記為AS(用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇調(diào)零)。按照相同的操作方法，以2.0 mL無(wú)水乙醇代替DPPH·-乙醇溶液，測(cè)吸光度值，記為A；以2.0 mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液，測(cè)吸光度值，記為A0，DPPH·清除率計(jì)算公式為：DPPH·清除率(%)=( 1-(AS-A)/A0)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解方法對(duì)海地瓜多肽和多糖提取率的影響

2.1.1 蛋白酶的篩選

由表1可以看出，從提取多肽的角度出發(fā)，胰蛋白酶的酶解效果最佳，可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解所得，且總糖含量最低，這可能是由于胰蛋白酶作為動(dòng)物性蛋白酶對(duì)肽鍵斷裂作用專一性較高造成的。

從提取多糖的角度出發(fā)，作用譜廣的微生物酶中性蛋白酶的酶解效果最佳，酶解液中總糖含量最高，木瓜蛋白酶酶解能力稍弱。故選用胰蛋白酶對(duì)原料液進(jìn)行一次酶解，酶解條件參照文獻(xiàn)[28]。然后通過(guò)截留分子質(zhì)量10 ku的超濾膜分離得到分子質(zhì)量相對(duì)較小海地瓜多肽，提取率達(dá)到海地瓜體壁干質(zhì)量的(29.602±1.012)%，重復(fù)性好且純度較高，殘留糖含量控制在2%以下。

利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)一次酶解沉淀及超濾截留液開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，提取海地瓜粗多糖。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。中性蛋白酶酶解條件為：pH值7.0，加酶量4%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h。木瓜蛋白酶酶解條件為：酶解pH值7.0，加酶量4%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h。改變其中一個(gè)條件，保持其他條件不變，分別考察不同影響因素對(duì)多糖提取率的影響。各因素取值范圍：酶解pH值為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；加酶量為1%，2%，4%，6%，8%；酶解溫度為40，50，60，70 ℃；酶解時(shí)間為2，4，6，8，10 h。

表1 最佳蛋白酶篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 酶解條件單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可以看出，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，中性蛋白酶的多糖提取率逐漸增大，2～8 h之內(nèi)增大趨勢(shì)明顯，8 h之后趨于平緩。這是因?yàn)槿芤赫吵斫档兔阜肿拥囊苿?dòng)性，不利于酶解反應(yīng)進(jìn)行，此時(shí)酶解產(chǎn)物達(dá)到飽和，阻礙多糖釋放。在2～8 h之內(nèi)，木瓜蛋白酶的多糖提取率同樣逐漸升高，8 h時(shí)提取率最高，之后有所降低。

2.1.2.2 加酶量對(duì)多糖提取率的影響

由圖2可以看出，隨著加酶量的增大，中性蛋白酶多糖提取率迅速上升， 6%時(shí)達(dá)到最大值，而后出現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)殡S著加酶量的增大，酶解程度加深，酶解液粘度有所升高，部分多糖被各種雜質(zhì)吸附形成沉淀。木瓜蛋白酶多糖提取率隨加酶量的增大而增大，6%之后繼續(xù)增大加酶量，提取率增大幅度變小。因?yàn)榇藭r(shí)酶解已達(dá)到飽和，底物濃度不變，即使增大加酶量，沒(méi)有充足底物與酶結(jié)合，多糖提取率也不會(huì)有大幅度的增加。

2.1.2.3 酶解pH值對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可以看出，酶解pH值對(duì)中性蛋白酶多糖提取率的影響程度很小，pH值在6.0～7.0內(nèi)，多糖提取率只有小幅度的升高，pH值在7.0以上時(shí)，多糖提取率幾乎沒(méi)有變化。酶解pH值對(duì)木瓜蛋白酶多糖提取率的影響則比較明顯，pH值在6.0～7.0內(nèi)，多糖提取率隨著pH值的增大而增大，pH值在7.0時(shí)多糖提取率達(dá)到最大，之后逐漸減小。因此，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值均控制在7.0左右，這與酶制劑說(shuō)明書的描述一致。

2.1.2.4 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖4可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的多糖提取率隨著溫度的升高均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。酶解溫度在50 ℃時(shí)，中性蛋白酶的多糖提取率最高；酶解溫度在60 ℃時(shí)，木瓜蛋白酶的多糖提取率最高。另外，由圖4還可以看出，酶解溫度對(duì)中性蛋白酶的影響程度更明顯。

2.1.3 酶解條件正交試驗(yàn)

2.1.3.1 中性蛋白酶正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)考察中性蛋白酶酶解時(shí)間、加酶量、酶解pH值、酶解溫度4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，各因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，在各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)中性蛋白酶多糖提取率的影響主次順序?yàn)椋杭用噶?酶解溫度>pH值>酶解時(shí)間。得到中性蛋白酶的最優(yōu)酶解條件A1B3C2D1：酶解時(shí)間為8 h，加酶量為7%，pH值為7.0，酶解溫度為45 ℃。在該條件下經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到海地瓜體壁多糖提取率為體壁干重的(10.863±0.120)%。

表2 中性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表

表3 中性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3.2 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)考察木瓜蛋白酶酶解時(shí)間、加酶量、pH值、酶解溫度4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，各因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，在各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)木瓜蛋白酶多糖提取率的影響主次順序?yàn)椋杭用噶?pH值>酶解溫度>酶解時(shí)間，得到木瓜蛋白酶的最優(yōu)酶解條件A2B3C2D2：酶解時(shí)間為8 h，加酶量為8%，pH值為7.0，酶解溫度為60 ℃。在該條件下經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到海地瓜體壁多糖提取率為體壁干質(zhì)量的(9.364±0.173)%。

表4 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表

表5 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 雙酶體系復(fù)合酶解試驗(yàn)

通過(guò)酶的篩選試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇多糖提取率較高的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，比較單酶酶解和雙酶復(fù)配使用對(duì)海地瓜多糖提取率的影響。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值均為7.0。因此結(jié)合正交試驗(yàn)所得兩種單酶的最優(yōu)條件，在不同的組合方式下，僅改變酶解溫度和酶解時(shí)間，不同酶解的設(shè)計(jì)方案見表6。由表6可知，在酶解時(shí)間一定的情況下雙酶復(fù)配使用，無(wú)論是混合酶解還是分步酶解，均比單酶酶解效果好。這與不同蛋白酶底物特異性及活性中心不同有關(guān)，酶復(fù)配使用大大增加了其可酶解的底物范圍，多糖提取率明顯升高。而分步后酶解方案5和方案6的多糖提取率均比復(fù)合酶解型的高，這可能是因?yàn)閮煞N酶混合使用影響了各自的活性，而且無(wú)法同時(shí)兼顧兩種酶的最優(yōu)酶解條件。分步酶解兩種方案又以中性蛋白酶在先的效果更好，所以方案5為最佳酶解方案，即：先加入中性蛋白酶，在加酶量7%、酶解溫度45 ℃的條件下水解4 h，再加入木瓜蛋白酶，在加酶量8%、酶解溫度60 ℃的條件下水解4 h，整個(gè)過(guò)程pH值均為7.0，多糖提取率最高，達(dá)到了(14.511±0.162)%，重復(fù)性良好。

目前使用雙酶或多酶體系來(lái)提高多糖提取率的研究已有很多報(bào)道：展學(xué)孔等[29]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶雙酶體系先后水解的方式提取海參多糖，本文研究結(jié)果與其一致，效果良好；冀利等[30]以濃縮棗汁超濾截留液為原料，選用植物蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶3種酶分步水解金絲小棗蛋白，提取了多糖和多肽。

表6 單酶與雙酶提取率比較

說(shuō)明：A—中性蛋白酶，B—木瓜蛋白酶；Ⅰ型—單酶酶解，Ⅱ型—雙酶混合酶解，Ⅲ型—雙酶先后酶解

Notes：A—neutral proteinase;B—papain;I—single enzymolysis；Ⅱ—mixed enzymolysis;Ⅲ—mixed enzymes successively enzymolysis

2.2 海地瓜多肽和多糖的超濾法分離分級(jí)

2.2.1 超濾條件的優(yōu)化

2.2.1.1 操作壓力對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響

在料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、操作溫度為25 ℃的條件下，研究不同操作壓力(0.10，0.15，0.20，0.25 MPa)對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，在0.10～0.25 MPa的壓力范圍內(nèi)，膜通量隨操作壓力升高而增加，當(dāng)其操作壓力上升到 0.20 MPa 以后，增加幅度趨于平緩。隨著壓力的增加，被截留的大分子物質(zhì)在膜表面不斷累積吸附，最終達(dá)到飽和形成凝膠層。此時(shí)，繼續(xù)增加壓力，除了增加能耗外，只會(huì)增加凝膠層的厚度、致密度和傳質(zhì)阻力，加重膜污染。因此，當(dāng)壓力達(dá)到0.20 MPa 以后，膜通量減緩，膜效能由增大變?yōu)闇p小。結(jié)合膜通量和膜效能兩項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮，操作壓力選擇0.20 MPa為宜。

2.2.1.2 料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響

在操作壓力為0.20 MPa、操作溫度為25 ℃的情況下，研究不同料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%，2%，4%，6%，8%)對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，膜通量隨著料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低。這是因?yàn)榱弦吼ざ扰c溶質(zhì)濃度成正比，而粘度越高，擴(kuò)散系數(shù)越小，膜表面越易出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，形成凝膠層，導(dǎo)致膜通量下降。但是低濃度料液中小分子溶質(zhì)含量少，膜效能很低，隨著料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，膜效能顯著增大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí)膜效能增大幅度明顯減小。綜合考慮產(chǎn)品利用率、生產(chǎn)效率等，確定料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。

2.2.1.3 操作溫度對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響

在操作壓力為0.20 MPa、料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的條件下，研究不同操作溫度(15，25，35，45 ℃)對(duì)超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，溫度升高，膜通量和膜效能都隨之增大。這是因?yàn)榱弦吼ざ入S溫度上升而下降，因而擴(kuò)散系數(shù)增加，濃差極化影響降低，有效延緩了膜表面凝膠層的形成。但是，溫度升高使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)體積膨脹而結(jié)構(gòu)變得疏松不規(guī)則，易造成堵塞污染或吸附污染。當(dāng)溫度升高到35 ℃時(shí)，膜效能增加幅度明顯降低。綜合考慮膜通量和膜效能大小及經(jīng)濟(jì)效益，本實(shí)驗(yàn)采用35 ℃作為超濾溫度。

2.2.2 海地瓜多肽和多糖的超濾分離分級(jí)

超濾分級(jí)得到3個(gè)不同分子質(zhì)量段5～10 ku、1～5 ku和<1 ku的海地瓜多肽，分別命名為P1、P2和P3。經(jīng)測(cè)定各組分中多肽含量，計(jì)算得到不同分子質(zhì)量段海地瓜多肽在海地瓜多肽混合液中所占比例：P1(48.47%)，P2(18.46%)，P3(33.07%)。

超濾得到4個(gè)不同分子質(zhì)量段(<10 ku，10～100 ku，100～200 ku，>200 ku)的海地瓜多糖，分別命名為G1、G2、G3和G4，測(cè)定4個(gè)組分中的化學(xué)組成如表7。由表7可見，隨著分子質(zhì)量的增大，海地瓜粗多糖中總糖含量逐漸增加，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，分子質(zhì)量大于200 ku的粗多糖G4中總糖含量已升至55.99%，蛋白質(zhì)含量已降至6.33%。故本研究只對(duì)所占比例較高且雜質(zhì)最少的粗多糖G4進(jìn)一步分級(jí)純化。

表7 海地瓜多糖的化學(xué)組成

2.2.3 粗多糖G4的離子交換柱層析法純化

樣品經(jīng)初始Tris-HCl緩沖液(含0 mol/L NaCl)洗脫和0～4 mol/L NaCl線性洗脫后，選擇了NaCl濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0 mol/L的洗脫鹽對(duì)海地瓜多糖G4進(jìn)行等梯度洗脫，洗脫峰如圖8所示。由圖8分析確定NaCl洗脫鹽濃度為0，0.5，1.5 mol/L，洗脫出現(xiàn)3個(gè)主要的多糖峰，洗脫濃度的增大說(shuō)明多糖組分中與凝膠發(fā)生離子交換作用的物質(zhì)逐漸增多，可以推測(cè)最后一種多糖中含有最多的酸根離子。另外，由圖8還可以看出，多糖峰二與蛋白質(zhì)檢測(cè)峰重合，推測(cè)其成分可能為糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。多糖峰三無(wú)蛋白質(zhì)檢出，推測(cè)可能是一種組分單一的多糖。合并收集粗多糖洗脫曲線三個(gè)峰值處的多糖組分，經(jīng)除鹽、濃縮、冷凍干燥處理后，低溫干燥環(huán)境中儲(chǔ)藏，得到海地瓜多糖呈乳白色棉絮狀，分別命名為G4-1、 G4-2和 G4-3。G4經(jīng)過(guò)離子交換柱分離純化得到的3種純多糖的化學(xué)組成差異很大，說(shuō)明相同分子質(zhì)量范圍內(nèi)存在不同的多糖的組分，可以通過(guò)柱層析的方法分離。柱層析純化多糖G4-1、G4-2、G4-3的化學(xué)組成如表7，其中G4-2蛋白質(zhì)含量較高，占21.98%，進(jìn)一步驗(yàn)證了G4-2洗脫過(guò)程中出現(xiàn)蛋白峰的原因，即G4-2是一種糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。G4-3中幾乎不含蛋白質(zhì)，硫酸根和巖藻糖含量很高，說(shuō)明G4-3是高度硫酸酯化的巖藻聚糖。而G4-1中巖藻糖含量最高，達(dá)到43.98%，氨基己糖、葡萄糖醛酸及硫酸根含量最低，說(shuō)明G4-1是一種純度較高的同多糖，這也是G4-1能被不含NaCl的洗脫液最先洗脫下來(lái)的原因。

2.3 海地瓜多肽和多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除羥基自由基(·OH)的能力

由圖9～圖11可以看出，海地瓜多肽、粗多糖和純化多糖的·OH清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增大顯著增強(qiáng)，且均高于Vc。不同分子質(zhì)量段海地瓜多肽的·OH清除能力隨著分子質(zhì)量的增大而降低，且差異較顯著，分子質(zhì)量最小P3對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)。不同分子質(zhì)量段粗多糖中，G4的清除能力最強(qiáng)，質(zhì)量濃度在6 g/L時(shí)·OH清除率已達(dá)到(98.42±1.89)%。3種海地瓜純化多糖中，G4-1的·OH清除能力最強(qiáng)。

2.3.2 清除1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)的能力

由圖12可以看出，Vc在較低的質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出很強(qiáng)的DPPH·清除能力，而且隨質(zhì)量濃度增加，增幅較大。對(duì)比圖13—圖15可以看出，海地瓜多肽、粗多糖和純化多糖組分的DPPH·清除能力均隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，但是均低于Vc。海地瓜不同分子質(zhì)量段多肽中，P2的DPPH·清除能力最強(qiáng)，在1～4 g/L范圍內(nèi)清除率迅速增大，之后保持很小幅度緩慢增大。海地瓜粗多糖中，G4在低質(zhì)量濃度時(shí)表現(xiàn)出的DPPH·清除能力較弱，2～4 g/L范圍內(nèi)DPPH·清除率迅速升高，從(24.02±1.22)% 增至(79.11±1.72)%，之后一直保持最強(qiáng)的DPPH·清除能力。3種海地瓜純化多糖中，G4-2的DPPH·清除能力最強(qiáng)，且在較低質(zhì)量濃度1 g/L時(shí)，DPPH·清除率已達(dá)到(42.56±1.04)%，但增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)比較平緩。與·OH清除能力類似，G4-3的DPPH·清除能力最弱。

3 結(jié)論

1)本實(shí)驗(yàn)中選用胰蛋白酶對(duì)海地瓜體壁干粉進(jìn)行一次酶解，在料液比(m/V)1∶40、加酶量2.4%、 pH 7.5、酶解溫度45 ℃的條件下酶解8 h。然后通過(guò)截留分子質(zhì)量10 ku的超濾膜分離得到海地瓜多肽，提取率達(dá)到(29.602±1.012)%。選用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合使用進(jìn)行二次酶解：先加入7%的中性蛋白酶，45 ℃酶解溫度下酶解4 h；再加入8%的木瓜蛋白酶，60 ℃酶解溫度下酶解4 h，整個(gè)過(guò)程pH值均為7.0，多糖提取率達(dá)到(14.511±0.162)%。

2)本實(shí)驗(yàn)中得到的最佳超濾條件為：操作壓力為0.20 MPa，料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，操作溫度為35 ℃。按照從大分子質(zhì)量到小分子質(zhì)量的順序?qū)５毓隙嚯倪M(jìn)行超濾分級(jí)，得到3個(gè)不同分子質(zhì)量段的海地瓜多肽： P1(5～10 ku，48.47%)，P2(1～5 ku，18.46%)，P3(<1 ku，33.07%)。按照從小分子質(zhì)量到大分子質(zhì)量的順序?qū)５毓隙嗵沁M(jìn)行超濾分級(jí)，得到4個(gè)不同分子質(zhì)量段的海地瓜粗多糖： G1(<10 ku，63.09%)，G2(10～100 ku，7.24%)，G3(100～200 ku，4.67%)，G4(>200 ku，25.00%)。

3)采用Q-Sepharose-Fast-Flow陰離子交換柱層析法對(duì)G4進(jìn)行純化，在0，0.5，1.5 mol/L洗脫鹽濃度下，得到3種多糖組分G4-1、 G4-2和 G4-3。透析除鹽、冷凍干燥得到乳白色棉絮狀多糖樣品。

[]

[1]玉麟.中國(guó)動(dòng)物志：棘皮動(dòng)物門海參綱[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[2]王方國(guó)，張海生，周懷陽(yáng).海地瓜的營(yíng)養(yǎng)成分及其開發(fā)利用設(shè)想[J].中國(guó)海洋藥物，1998，66(2)：52-54.

[3]伏緯華，吳鳳梧，戚寶鳳，等.海地瓜的研究-Ⅱ：海地瓜與黃玉海參營(yíng)養(yǎng)成分的比較[J].中國(guó)海洋藥物，1994，51(3):28-30.

[4]TAKASHI H，NOBUHIRO Z，KYOKO Y，et al.Recent advances in researches on physiologically active substances in holothurians[J].Journal of Ocean University of China，2005，4(3)：193-197.

[5]LIU X，SUN Z，ZHANG M，et al.Antioxidant and antihyperlipidemic activities of polysaccharides from sea cucumberApostichopusjaponicus[J].Carbohydrate Polymers，2012，90(4)：1664-1670.DOI:10.1016/j.carbpol.2012.07.047.

[6]LUO L，WU M，XU L，et al.Comparison of physicochemical characteristics and anticoagulant activities of polysaccharides from three sea cucumbers[J].Marine Drugs，2013，11(2)：399- 417.

[7]CHOO P S.Population status，fisheries and trade of sea cucumbers in Asia[J].Fao Fisheries & Aquaculture Technical Paper，2008，5(16)：81-118．

[8]PURCELL S W.Value，market preferences and trade of Bechedemer from Pacific Island sea cucumbers[J].Plos One，2014，9(4)：1-8.

[9]BORDBAR S，ANWAR F，SAARI N.High-value components and bioactives from sea cucumbers for functional foods:a review[J].Marine Drugs，2011，9(10)：1761-1805.DOI:10.3390/md9101761.

[10]KARIYA Y，MULLOY B，IMAI K，et al.Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumberStichopusjaponicusand their ability to inhibit osteoclastogenesis[J].Carbohydrate Research，2004，339(7)：1339-1346.DOI:10.1016/j.carres.2004.02.025.

[11]WU M，XU S，ZHAO J，et al.Physicochemical characteristics and anticoagulant activities of low molecular weight fractions by free-radical depolymerization of a fucosylated chondroitin sulphate from sea cucumberThelenataananas[J].Food Chemistry，2010，122(3)：716-723.

[12]WANG Y，SU W，ZHANG C，et al.Protective effect of sea cucumber(Acaudinamolpadioides) fucoidan against etha-nol-induced gastric damage[J].Food Chem，2012，133(4):1414-1419.DOI:10.1016/j.foodchem.2012.02.028.

[13]劉程惠，朱蓓薇，董秀萍，等.海參酶解產(chǎn)物的分離及其體外抗氧化作用的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(9)：50-53.

[14]LI Z,WANG H， LI J，et al.Basic and clinical study on the antithrombotic mechanism of glycosaminoglycan extracted from sea cucumber[J].Chinese Medical Journal，2000，113：8-13.

[15]ALTHUNIBAT O Y，HASHIM R B，TAHER M，et al.Invitroantioxidant and antiproliferative activities of three Malaysian sea cucumber species[J].European Journal of Scientific Research，2009，37(3)：376-387.

[16]PAN S K，YAO D R，ZHOU M Q，et al.Hydroxyl radical scavenging activity of peptide from sea cucumber using enzyme complex isolated from the digestive tract of sea cucumber[J].African Journal of Biotechnology，2012，11(5)：1214-1219.DOI:10.5897/AJB11.2578.

[17]LIU C H，WANG X J，YUAN W P，et al.Anti-fatigue and immune functions of sea cucumber oral liquid[J].Modern Food Science and Technology，2009，25(10)：1115-1119.

[18]MAMELONA J，SAINT L R，PELLETIER E.Nutritional composition and antioxidant properties of protein hydrolysates prepared from echinoderm by products[J].International Journal of Food Science & Technology，2010，45(1)：147-154.DOI：10.1111/j.1365-2621.2009.02114.x.

[19]DUBOIS M， GILLES K A,HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Biochemistry，1956，28(3)：350-356.

[20]LOWRY O H，ROSEBROUGH N J ，F(xiàn)ARR A L ，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Biological Chemistry，1951，193：265-275.

[21]陳山，楊曉泉，郭祀遠(yuǎn)，等.大豆肽超濾分離純化過(guò)程的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29:49-52.

[22]厲朝龍.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，2003：16-22.

[23]李貴榮.枸杞多糖的提取及其對(duì)活性氧自由基的清除作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2002，19(2)：94-96.

[24]梁引庫(kù).黃精多糖的脫色和脫蛋白及體外抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(5)：240-243.

[25]張婭，李寶才.松茸多糖超聲提取物抗氧化活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2011，28(9)：75-82.

[26]HATANO T，KAGAWA H，YASUHARA T ，et al.Two new flavonoids and other constituents in licorice root：their relative astringency and radical scavenging effects[J].Chemistry of Pharmacology Bulletin，1988，36(6)：2090-2097.DOI：10.1248/cpb.36.2090.

[27]WU H，CHEN H，SHIAU C.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomberaustriasicus)[J].Food Research International，2003，36(9)：949-957.DOI:10.1016/S0963-9969(03)00104-2.

[28]馮駿.海參多糖的分離純化與化學(xué)組成的研究[D].廈門：集美大學(xué)，2014.

[29]展學(xué)孔，周海妹，馬小花，等.海參多糖提取新工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(15)：40- 42.

[30]冀利，孫曙光，孫玖玉，等.從濃縮棗汁超濾截留液中提取金絲小棗多肽和多糖[J].山東食品發(fā)酵，2013，168(1)：3-10.

[31]羅曉航.PEF結(jié)合酶法提取鮑魚臟器粗多糖及其抗氧化活性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[32]李霞，張峰，李永才，等.蘭州百合不同部位多糖含量及抗氧化活性的比較[J].食品工業(yè)科技，2012(24)：88-91.