雜色鮑幼蟲變態(tài)及TR干擾下內(nèi)參基因的篩選

張麗莉，徐建波，王國棟，王藝?yán)?/p>

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

實(shí)時(shí)定量PCR(real time quantitative PCR)是在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，通過觀測熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR整個(gè)進(jìn)程，可以獲得PCR每一輪循環(huán)的擴(kuò)增效果。因它能夠充分利用PCR高靈敏性準(zhǔn)確檢測目標(biāo)基因表達(dá)水平，被廣泛用于基因表達(dá)研究中。用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行基因的表達(dá)水平檢測時(shí)，樣品RNA的得率、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率等對實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果影響巨大。為了獲得目標(biāo)基因真實(shí)的表達(dá)情況，必須選擇內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[1]。因此，選擇的內(nèi)參基因是否合適是影響實(shí)時(shí)定量PCR分析基因表達(dá)水平的重要因素之一。理想的內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)不受試驗(yàn)因素的影響，能在整個(gè)試驗(yàn)過程中恒定表達(dá)，即在不同處理、不同細(xì)胞、不同發(fā)育階段均能恒定表達(dá)。一般認(rèn)為管家基因能夠在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，所以一些管家基因如肌動(dòng)蛋白(ACT)、18S核糖體RNA(18SrRNA)、28S核糖體RNA(28SrRNA)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等常作為內(nèi)參基因。然而近年來的研究表明，這些常用內(nèi)參基因常常受到細(xì)胞類型、發(fā)育階段和各種試驗(yàn)條件的影響，其表達(dá)量通常也會(huì)有所不同[2]。Chen等[3]篩選獲得鮑早期發(fā)育階段(受精卵到匍匐幼蟲階段)的4個(gè)表達(dá)穩(wěn)定基因(YB1、OAZ1、EIF5A和RPL3)都不是常見的內(nèi)參基因。因此，傳統(tǒng)的內(nèi)參基因很可能不適合作為變態(tài)過程的內(nèi)參基因。

同大部分海洋無脊椎動(dòng)物一樣，鮑的生活史具有浮游和底棲兩個(gè)階段。其幼蟲通過變態(tài)過程進(jìn)行機(jī)體結(jié)構(gòu)和生態(tài)習(xí)性兩方面的改變，成為與成體類似的稚體。因?yàn)轷U幼蟲營卵黃營養(yǎng)，在浮游生活階段不攝食，變態(tài)過程中營養(yǎng)因素容易控制，成為研究浮游幼蟲變態(tài)的模式之一[4]。此外，變態(tài)是鮑個(gè)體發(fā)育的重要過程，且死亡率高，所以變態(tài)過程是鮑苗種生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而成為水產(chǎn)科技人員重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一。目前，鮑變態(tài)機(jī)制的研究已深入到分子層次，篩選與變態(tài)相關(guān)基因及關(guān)鍵基因在變態(tài)過程的功能注釋成為研究的重點(diǎn)。變態(tài)相關(guān)基因的篩選主要通過比較變態(tài)前后其表達(dá)量來獲得，而基因的功能驗(yàn)證則常采用RNAi。在這些研究中，實(shí)時(shí)定量PCR是重要的研究手段。而內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定程度是影響定量PCR準(zhǔn)確性的主要因素之一。

目前在鮑發(fā)育和變態(tài)過程中內(nèi)參基因主要選擇仍是β-actin、18SrRNA或28SrRNA等，也未見對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估。本文擬對雜色鮑(Haliotisdiversicolor)變態(tài)前后及幼蟲RNAi試驗(yàn)進(jìn)行內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估。因鮑早期發(fā)育階段和變態(tài)階段具有類似的細(xì)胞學(xué)過程，所以本文依據(jù)Chen等[3]的篩選結(jié)果，選取了EIF5A、OAZ1、YB1和RPL3作為候選基因。此外，ACT和RPS9在鮑不同組織中具有較高的表達(dá)穩(wěn)定性，表明其細(xì)胞類型和細(xì)胞分化對這兩個(gè)基因影響不大，因此也選作候選基因。本文還對6個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了篩選，希望能為鮑幼蟲變態(tài)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 幼蟲培育及變態(tài)前后樣品收集

選取性腺發(fā)育飽滿、機(jī)體無損傷的雜色鮑雌雄各30只(殼長4.5～5.0 cm)作為親鮑。待陰干0.5～1 h后，分雌雄分別放入受紫外線照射(200～300 mW·h/L)的海水中，并進(jìn)行±3 ℃的變溫刺激。等卵子充分排放后，收集卵子并將其密度控制在20～100個(gè)/mL。同時(shí)收集精子，保證每個(gè)卵子周圍有3～5個(gè)精子，并攪動(dòng)水體，使之結(jié)合。受精后每隔30 min洗卵一次，并在顯微鏡下及時(shí)觀察發(fā)育狀況。胚胎發(fā)育和幼蟲培育過程中水溫23.7～28.5 ℃，鹽度32.8～34.5。每天顯微鏡觀察、拍照，收集變態(tài)前的感受態(tài)面盤幼蟲(veliger ，VE)、變態(tài)時(shí)期的匍匐幼蟲(creeping period ，CR)以及變態(tài)后的稚鮑(juvenile，JU)樣品，液氮速凍后存于-80 ℃待用。

1.2 幼蟲RNAi試驗(yàn)

當(dāng)80%幼蟲出現(xiàn)眼點(diǎn)時(shí)將之視作CR。用200目篩絹收集此時(shí)期幼蟲，并用0.2 μm過濾海水沖洗幼蟲3次，再用過濾海水將幼蟲密度調(diào)整為100個(gè)/mL，然后取10 mL含幼蟲過濾海水于15 mL試管中。將試管分為3組，每組5個(gè)。一組加入甲狀腺激素受體(TR)dsRNA，將其終質(zhì)量濃度調(diào)整為5 μg/mL，作為試驗(yàn)組；一組加入GFP dsRNA，同樣將其終質(zhì)量濃度調(diào)整為5 μg/mL，作為陰性對照組；還有一組不添加任何物質(zhì)，作為空白對照組。處理2 h后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至1 L底部鋪有底棲硅藻的燒杯中。在燒杯中繼續(xù)培養(yǎng)10 h，此時(shí)對照組大部分幼蟲已完成變態(tài)，及時(shí)收集幼蟲，液氮速凍后，存于-80 ℃待用。

1.3 雜色鮑幼蟲變態(tài)過程總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

取凍存于-80 ℃冰箱中的雜色鮑幼蟲樣品50 mg，快速置于已加有1 mL Trizol試劑并于冰上保存的2.0 mL離心管中，冰上勻漿至無顆粒狀殘留物，并按照Trizol試劑說明書提取總RNA。RNA沉淀用RNase free滅菌水溶解，對于已溶解的RNA溶液，分別采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法來檢測RNA的濃度、純度以及完整性。并用Dnase I處理后用于后續(xù)的cDNA第一條鏈的合成。

取2 μg經(jīng)Dnase I處理的總RNA，由隨機(jī)引物(2 μL，10 mmol/L)經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 dsRNA制備

雜色鮑 TR的片段(521～1056 bp，KT023066)分別由引物dsTR-FT7和dsTR-R(或dsTR-F和dsTR-RT7)以cDNA第一條鏈作為模板，擴(kuò)增后作為體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄模板。同樣綠色熒光蛋白657 bp的片段也分別由dsGFP-FT7和dsGFP-R(或dsGFP-F和dsGFP-RT7)以cDNA第一條鏈作為模板，擴(kuò)增后作為轉(zhuǎn)錄模板。將上述模板割膠回收，測序確認(rèn)后，用T7 RNA聚合酶(Promega)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA(ssRNA)。用來自同一基因片段正負(fù)鏈ssRNA等量混合在含NaCl 400 mmol/L、Tris-Cl10 mmol/L的緩沖液(pH=7.4)中，經(jīng)75 ℃、65 ℃和25 ℃各孵育15 min，形成dsRNA。

表1 dsRNA合成所用引物

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件

采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL(10 μmol/L)，cDNA模板(100倍稀釋液)9 μL。采用LightCycler?480實(shí)時(shí)定量PCR儀，首先95 ℃變性5 min;然后以95 ℃變性 10 s，58 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行45次。待擴(kuò)增曲線完成后，進(jìn)行溶解曲線分析，以確保每對定量引物擴(kuò)增得到單一的產(chǎn)物。每個(gè)時(shí)期做5個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。采用溶解曲線分析其是否為單峰，且檢查陰性對照(不加模板)是否采集到熒光信號(hào)。用1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴(kuò)增長度是否符合預(yù)期。同時(shí)，注意是否存在引物二聚體和非特異性擴(kuò)增條帶等。

1.6 引物擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)

引物擴(kuò)增效率(E)的計(jì)算方程式為：E=10-(1/斜率)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，將cDNA第一鏈模板逐次進(jìn)行5倍稀釋，獲得5個(gè)模版濃度梯度，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，檢驗(yàn)EIF5A、OAZ1、YB1、RPL3、RPS9、ACT6個(gè)候選內(nèi)參基因定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)。

1.7 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

定量PCR完成后，導(dǎo)出各樣品的Ct值，采用GeNorm、normFinder和RefFinder等程序軟件分析在雜色鮑幼蟲變態(tài)三個(gè)時(shí)期和RNAi實(shí)驗(yàn)條件下6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。GeNorm、normfinder中M值(average expression stability values)的計(jì)算公式為：M=2-ΔCt。

依據(jù)M值對各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和排序，M值越小越穩(wěn)定，反之越不穩(wěn)定。RefFinder整合GeNorm和Normfinder的分析方法，再由各自分析方法得到的內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性排名來計(jì)算幾何平均值，最后得到一個(gè)綜合排名指數(shù)，該指數(shù)越小表示對應(yīng)的內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 候選內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增

通過對梯度稀釋的模板進(jìn)行qRT-PCR檢驗(yàn)，獲得候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率E在95.32%～103.21%之間，相關(guān)系數(shù)R2變化范圍為0.9893～0.9997(見表2)，且溶解曲線分析結(jié)果為單峰。

表2 所用候選內(nèi)參基因、引物序列及PCR擴(kuò)增效率

用瓊脂糖凝膠電泳檢測定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果(見圖1)表明：6個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增長度與預(yù)期一致，沒有出現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

2.2 幼蟲附著變態(tài)過程內(nèi)參基因篩選

借助GeNorm軟件[5]根據(jù)ΔCt計(jì)算可獲得M值。M值越小基因表達(dá)越穩(wěn)定，反之越不穩(wěn)定。圖2顯示，在雜色鮑幼蟲變態(tài)發(fā)育的三個(gè)時(shí)期(VE、CR、JU)，候選內(nèi)參基因EIF5A和ACT的M值最小(M=0.182)，具有較高的穩(wěn)定性；而RPS9的M值(0.732)最大，穩(wěn)定性較差。

normFinder軟件[6]也是由ΔCt計(jì)算出M值。經(jīng)該軟件計(jì)算，在雜色鮑幼蟲變態(tài)三個(gè)時(shí)期中，M值最小的是EIF5A(0.091)，OAZ1次之(0.097)，ACT、YB1和RPL3的M值在0.281至0.633之間，最大的是RPS9(1.268)。

RefFinder軟件[7]獲得的指數(shù)越小，則該內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定。在雜色鮑幼蟲變態(tài)三個(gè)時(shí)期中，候選內(nèi)參基因M值最小的是EIF5A(1.316)，OAZ1、ACT和YB1的M值在2.213至2.828之間，RPL3和RPS9的M值較大(分別為5和6)。

根據(jù)3種軟件給出的排名計(jì)算幾何平均數(shù)，將這6個(gè)基因進(jìn)行綜合排名，結(jié)果見表3。3種軟件對EIF5A、YB1、RPL3和RPS9的排名完全一致。只有GeNorm對OAZ1和ACT的排名與其他軟件不一致。經(jīng)計(jì)算排名幾何平均數(shù)，得出這6個(gè)基因在變態(tài)過程中的穩(wěn)定性由高到低為EIF5A>ACT>OAZ1>YB1>RPL3>RPS9。

表3 雜色鮑幼蟲變態(tài)期的6個(gè)參考基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3 雜色鮑幼蟲RNAi過程內(nèi)參基因篩選結(jié)果

GeNorm對6個(gè)基因在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性評(píng)估見圖3。RPS9和ACT的M值最小，都為0.041，穩(wěn)定性最高；YB1、RPL3、EIF5A和OAZ1的M值分別為0.211、0.255、0.313和0.347。

NormFinder給出的穩(wěn)定性前3位的基因與GeNorm一致，都是RPS9、ACT和YB1，其M值分別為0.021、0.021和0.272。EIF5A、OAZ1和RPL3的M值也較大，分別為0.344、0.347和0.353，但其大小順序與GeNorm有所不同。

RefFinder同樣判定RPS9為穩(wěn)定性最好的基因，其M值最小(1.316)；ACT的穩(wěn)定性次之，其M值為1.682；EIF5A、YB1、RPL3和OAZ1的穩(wěn)定性依次降低，其M值依次增大，分別為2.991、3.568、4.681和5.477。

計(jì)算3個(gè)軟件對這6個(gè)基因在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性的排名幾何平均數(shù)，結(jié)果見表4。3種軟件對RPS9和ACT的排名一致，分別位于第1和第2位；而YB1、EIF5A、RPL3和OAZ1的排名平均數(shù)依次增大。

表4 RNAi條件下雜色鮑幼蟲變態(tài)期候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排名

3 討論

正常組織中的細(xì)胞大部分完成分化，處于結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定時(shí)期。參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持和能量代謝的相關(guān)基因表達(dá)水平比較穩(wěn)定。所以多數(shù)情況下內(nèi)參基因都選擇參與這2個(gè)細(xì)胞學(xué)過程的基因。例如，在小鼠[1，9]、雞[10]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]、家蠶(Bombyxmori)[12]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[13]等進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的物種中，ACT、18SrRNA、28SrRNA、GADPH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)等參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持和基礎(chǔ)代謝的基因，都具有較好的穩(wěn)定性。

鮑幼蟲變態(tài)是一個(gè)發(fā)育過程。幼蟲特有結(jié)構(gòu)組織，如面盤、幼蟲收縮肌等，會(huì)退化崩解。而成體器官，如鰓、消化系統(tǒng)等，則會(huì)迅速形成。在變態(tài)階段機(jī)體的大部分細(xì)胞要么增殖分化要么發(fā)生凋亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化巨大，能量代謝波動(dòng)大。完成分化的細(xì)胞比例較少。因此，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持和能量代謝的基因穩(wěn)定性通常較差，選取常規(guī)的內(nèi)參基因往往不能滿足定量PCR的要求。

通過比較6個(gè)候選基因在感受態(tài)面盤幼蟲、匍匐幼蟲和變態(tài)后稚鮑3個(gè)階段的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)EIF5A表達(dá)最穩(wěn)定，這表明在鮑幼蟲變態(tài)前后EIF5A適合作為定量PCR的內(nèi)參基因。而在干擾TR的情況下，RPS9表達(dá)最穩(wěn)定。不同軟件的評(píng)價(jià)方法和目標(biāo)分析的側(cè)重點(diǎn)不同，所以對于同一數(shù)據(jù)的分析結(jié)果略有差異。因此，本文采用了多個(gè)軟件來分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，并采用排序的幾何平均數(shù)比較其穩(wěn)定性高低，這樣能夠更加全面地反映內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

EIF5A，即真核細(xì)胞翻譯起始因子5A，是真核生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種小分子蛋白，廣泛存在于真核生物和古細(xì)菌中，其序列具有高度保守性。它參與了蛋白質(zhì)合成[14-16 ]、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[17]、細(xì)胞增殖、凋亡[16]及環(huán)境脅迫抵抗。目前，EIF5A的功能研究主要集中于癌癥細(xì)胞發(fā)育和植物生長發(fā)育的作用分析。Chen等[3]通過轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析認(rèn)為EIF5A從卵裂到匍匐幼蟲階段的表達(dá)相對穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因，與本研究結(jié)果一致。尚未有EIF5A在貝類發(fā)育過程中作用的報(bào)道，但本研究發(fā)現(xiàn)其在雜色鮑中穩(wěn)定的表達(dá)水平，表明其可以作為貝類變態(tài)過程的內(nèi)參基因。又因其在植物生長發(fā)育過程中存在間歇和短暫的表達(dá)差異[17]，表明EIF5A的表達(dá)水平穩(wěn)定與否與物種和具體生物學(xué)過程相關(guān)。

核糖體蛋白S9(RPS9)同樣廣泛存在于各個(gè)物種中，具有高度保守性。它具有DNA修復(fù)、自體翻譯調(diào)控、發(fā)育調(diào)控和正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等功能。RPS9的表達(dá)水平研究相對較少。在細(xì)粒棘球絳蟲的發(fā)育過程中該基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在雜色鮑變態(tài)過程中RPS9的穩(wěn)定性是6個(gè)候選基因中最差的一個(gè)。而Chen等[3]在雜色鮑早期發(fā)育階段的內(nèi)參基因篩選中，沒有提到該基因。但是本研究也發(fā)現(xiàn)，在RNAi TR試驗(yàn)中，該基因穩(wěn)定性最高。這表明TR的干擾過程對RPS9的表達(dá)影響甚少。本文鮑幼蟲的TR干擾是通過添加外源dsRNA來實(shí)現(xiàn)的。為了保證足夠的dsRNA進(jìn)入幼蟲體內(nèi)，本研究采用的處理濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理濃度，這會(huì)對幼蟲的免疫和物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子產(chǎn)生影響。而細(xì)胞內(nèi)各個(gè)生物大分子是作為分子網(wǎng)絡(luò)成員發(fā)揮其作用的，某個(gè)分子功能和數(shù)量的變化會(huì)通過分子網(wǎng)絡(luò)影響其他成員，這可能是正常發(fā)育的變態(tài)過程和RNAi TR內(nèi)參基因穩(wěn)定性發(fā)生變化的主要原因。此外，在RNAi TR的試驗(yàn)處理中，為了節(jié)省dsRNA用量，極大提高了幼蟲密度。高密度及提高密度時(shí)對幼蟲的應(yīng)激反應(yīng)可能也是內(nèi)參基因穩(wěn)定性發(fā)生變化的原因。

每個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對分子網(wǎng)絡(luò)的影響都會(huì)不同。具體處理過程對實(shí)驗(yàn)對象的應(yīng)激反應(yīng)也存在差異。同一內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化。因此，本文建議在運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR研究基因表達(dá)水平時(shí)，需要對內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)估，篩選出適用于具體試驗(yàn)條件的內(nèi)參基因，以保證研究結(jié)果的可靠性。

ACT是一個(gè)常用的內(nèi)參基因。在正常發(fā)育和干擾TR下，穩(wěn)定性排名都位于第二位。本研究的前期研究表明ACT在弧菌感染雜色鮑前后是可以作為合適內(nèi)參的[19]。Zhang等[11]也在牙鲆中得出類似的結(jié)果。此外，周瑞雪等[19]認(rèn)為ACT在草魚早期發(fā)育中可作為最適內(nèi)參。蝦夷扇貝在饑餓處理下ACT同樣也是最適內(nèi)參[13]。因此，ACT可能是一個(gè)適用范圍較廣的內(nèi)參基因，可以作為一個(gè)通用的內(nèi)參基因。

YB1是一種核酸結(jié)合蛋白，參與了轉(zhuǎn)錄、翻譯、前mRNA剪接和DNA修復(fù)等多種細(xì)胞學(xué)過程[20]。Chen等[3]的研究結(jié)果表明從受精卵到稚貝大尺度的發(fā)育過程中，該基因表達(dá)穩(wěn)定性高于其他基因，是最佳的定量PCR內(nèi)參基因。但是鮑變態(tài)階段細(xì)胞數(shù)目大體穩(wěn)定，與鮑其他早期發(fā)育階段細(xì)胞數(shù)目快速增加有著明顯的不同[4]，這可能是變態(tài)過程該基因穩(wěn)定性較差的原因。OAZ1屬于鳥氨酸脫羧酶抗酶家族，通過抑制鳥氨酸脫羧酶來降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平，從而調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖[21]。OAZ1在受精卵到稚貝階段，具有較好的穩(wěn)定性，但是低于EIF5A和YB1[3]。而本文結(jié)果表明OAZ1基因的穩(wěn)定性位于EIF5A和YB1兩者之間。RPL3是核糖體蛋白60S亞基的組成元件，通常認(rèn)為具有較好的表達(dá)穩(wěn)定性[3]。但是在本研究的鮑變態(tài)階段和RNA干擾TR試驗(yàn)中，穩(wěn)定性較差與Chen等[3]的研究結(jié)果不同。OAZ1和RPL3穩(wěn)定性的差異同樣可能是變態(tài)過程造成的。本文RNA干擾TR處于變態(tài)階段，所以YB1、OAZ1和RPL3穩(wěn)定性也會(huì)受到影響，不如RPS9穩(wěn)定。

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