繡球菌富硒發(fā)酵工藝的研究

張磊 徐麗麗 趙子瞳 郭立忠

摘 要：硒是人體必需的微量元素之一。該實驗研究了富硒過程中硒對繡球菌生長的影響，以鄰苯二胺為顯色劑，采用紫外分光光度法，在25℃下，用甲苯作為萃取劑萃取硒和鄰苯二胺的作用產(chǎn)物，在波長335nm下測定其吸光度。實驗主要考察了繡球菌（荷仙菇-H）在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基中對硒的耐受能力，以及其在液態(tài)培養(yǎng)過程中生物量以及硒的富集率的動態(tài)變化。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的硒濃度在40mg/L以下時能夠促進(jìn)菌絲生長，高于40mg/L時硒對菌絲生長有抑制作用，最適的硒濃度為20mg/L，此時富硒率為30.71%。

關(guān)鍵詞：繡球菌；富硒；發(fā)酵

中圖分類號 S646.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）06-0123-04

Abstract：Selenium is one of the essential trace elements.The test studied effects of Selenium of the process of the growth and selenium enriched of Sparassiscrispa，with o-phenylenediamine as the chromogenic reagent，the absorbance of the formation of reaction between Se with o-phenylenediamine was determined at the wavelength of 335nm by the UV spectrophotometry.The tolerance of selenium in agar solid medium and the dynamic changes of the accumulation rate of selenium in liquid culture were studied.The test results showed that in the culture medium selenium concentration in below 40mg/L could promote the growth of mycelium，higher than 40mg/L selenium on mycelial growth inhibition，the optimum concentration of selenium is 20mg/L，the accumulation is rate of 30.71%.

Key words：Sparassiacrispa；Se-enrichment；Fermentation

繡球菌[Sparassiacrispa（Wulf.）Fr.]又名荷仙菇、繡球蕈、椰菜菌等，屬于擔(dān)子菌亞門、異隔擔(dān)子菌綱、無隔擔(dān)子菌亞綱、非褶孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬[1]。繡球菌含有多種人體必需的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、多種維生素、多種氨基酸、碳水化合物及膳食纖維等，特別是其子實體中最主要的活性成分β-葡聚糖，對人體具有補腎、潤肺、健腦、抗疲勞等多種功能，經(jīng)常食用能夠提高人體的免疫力，促進(jìn)人體的造血機制，并且對于癌癥、腫瘤等疾病的預(yù)防和改善有非常大的有益作用，具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值。

硒是人體中重要的微量元素之一，硒介入某些致癌物質(zhì)的代謝，抑制致癌中間物的產(chǎn)生；增強了體內(nèi)抑癌物的產(chǎn)生，形成克制了癌細(xì)胞分裂的內(nèi)環(huán)境。定量的硒的攝入會對人體抗癌防癌有一定功效。食用菌的富集功能可以把硒從無機狀態(tài)轉(zhuǎn)化為有機狀態(tài)，增強人體對硒的吸收，研究發(fā)現(xiàn)，食用菌所富集的有機狀態(tài)下的硒具有很好的穩(wěn)定性而且易于吸收效果。本課題對繡球菌對硒的富集進(jìn)行了研究，為繡球菌產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 供試菌種 繡球菌品種荷仙菇-H，由上海荷仙菇生物科技股份有限公司提供。

1.2 試劑和培養(yǎng)基 酵母粉（青島青藥生物工程有限公司）；蛋白胨（青島青藥生物工程有限公司）；大豆粉（陜西森弗天然制品有限公司）；KH2PO4（青島青藥生物工程有限公司）；亞硒酸鈉（青島青藥生物工程有限公司）；鄰苯二胺（山東佰仟化工有限公司）；濃硝酸（淄博庫侖分析儀器有限公司）；高氯酸（山東佰仟化工有限公司）；鹽酸（6mol/L，青島青藥生物工程有限公司）；氫氧化鈉（青島青藥生物工程有限公司）；5% EDTA-2Na溶液、1mg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液、1%鄰苯二胺溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）、甲苯；繡球菌固體培養(yǎng)基（玉米粉1.5%，麩皮粉0.5%，酵母1.0%，蛋白胨0.2%，大豆粉0.2%，KH2PO4 0.1%，瓊脂粉2%，pH5.5）；繡球菌液體培養(yǎng)基（玉米粉1.5%，麩皮粉0.5%，酵母1.0%，蛋白胨0.2%，大豆粉0.2%，KH2PO4 0.1%，pH5.5）；PDA培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器 生化培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療機械廠）；雙層恒溫?fù)u床（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；醫(yī)用離心機（長沙儀器儀表有限公司）；755紫外可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇潔凈化）；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器（三洋電機株式會社）。

2 實驗方法

2.1 菌種的活化 用打孔器將繡球菌斜面母種接入繡球菌培養(yǎng)基中，于25℃下活化培養(yǎng)20d，得活化菌種。

2.2 固體培養(yǎng) 按表1配制含不同濃度硒的繡球菌固體培養(yǎng)基，用打孔器將活化的10%繡球菌接種到培養(yǎng)基中，于25℃，恒溫培養(yǎng)20d。培養(yǎng)結(jié)束后，測定菌絲生物量和硒含量。每個平行3個重復(fù)。

2.3 液體菌種制備 用打孔器取10個繡球菌菌塊接種到盛有100mL種子培養(yǎng)液的250mL的三角瓶中，25℃，于搖床中120r/min震蕩培養(yǎng)10d得到液體菌種。

2.4 液體培養(yǎng) 按表2配制含不同濃度硒的繡球菌液體培養(yǎng)基，以10%的接種量把種子液接到不同硒濃度的培養(yǎng)基中，于25℃，120r/min，培養(yǎng)15～20d，培養(yǎng)結(jié)束后，測定菌絲生物量和硒含量、富硒率。

2.5 測試項目

2.5.1 菌絲生物量的測定 （1）液體發(fā)酵菌絲生物量的測定：發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心，去掉上清液，菌絲體用去離子水洗滌5次離心，置于烘箱中，60℃烘至衡重。（2）固體培養(yǎng)菌絲生物量的測定：培養(yǎng)基表面刮取菌絲，置于烘箱，60℃烘至衡重。

2.5.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 首先用1mg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度為4μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取0，1，2，3，4，5，6mL硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于50mL的比色管中，分別加蒸餾水定容至25mL，再加入5% EDTA-2Na溶液2mL，搖勻。用10M NaOH或乙酸調(diào)節(jié)溶液pH至2～2.5，再于黑暗處加入1%鄰苯二胺溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）2mL，搖勻后于黑暗處靜置反應(yīng)2h。反應(yīng)所得溶液中加入甲苯10mL，劇烈振蕩混勻后，靜置15min，再于OD335處測定溶液的吸光度，以不含硒的水溶液作為空白對照。以吸光度OD335為縱坐標(biāo)，含硒（μg）為橫坐標(biāo)，繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 樣品消化和測定 鄰苯二胺紫外分光光度法：準(zhǔn)確稱取0.lg樣品于250mL燒杯中，加入硝酸—高氯酸（4∶1，v/v）混合酸5mL，蓋上表面皿冷消化過夜。次日，于通風(fēng)櫥內(nèi)，用可調(diào)檔電爐加熱消化樣品，先用中火加熱，避免消化液中的酸與過多的有機物劇烈反應(yīng)而飛濺出來，待燒杯中的有機物基本溶解時，調(diào)高火加熱，使那些在低溫下不能被氧化分解的有機物徹底分解。等到溶液冒白煙時立即取下（此時溶液澄清或呈淡黃綠色）。稍冷后，于燒杯中加入6M HCl溶液4mL，再加熱至消化原點即可（冒白煙時立即取下）。用蒸餾水沖洗表面皿底部和燒杯壁，所得消化液過濾后，定容至25mL。再于所得溶液中加入5% EDTA-2Na 2mL，用l0M NaOH調(diào)節(jié)pH至2～2.5。在黑暗條件下，加入1%鄰苯二胺溶液2mL，搖勻，黑暗條件下靜置反應(yīng)2h。最后，反應(yīng)溶液加甲苯10mL萃取，劇烈振蕩使溶液混勻，靜置15min，再于335nm處測定萃取液的吸光度。結(jié)果以每1g菌絲（菌絲干重質(zhì)量）所含總硒的微克數(shù)來表示[14]。

2.5.4 富硒率的計算 計算公式如下：

富硒率=[富硒菌絲體的硒含量（μg/g）-空白菌絲體的硒含量（μg/g）]×富硒菌絲體干重（g/50mL）/培養(yǎng)基內(nèi)硒的含量（g/50mL）

3 結(jié)果與分析

3.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線 詳見圖1。

3.2 菌絲體生物量的變化 從圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基中加的亞硒酸鈉濃度低于40mg/L，硒元素可以促進(jìn)繡球菌菌絲的生長，在20mg/L時達(dá)到最高值0.1026g；超過40mg/L的亞硒酸鈉濃度對其菌絲體的生長有顯著的被壓制現(xiàn)象，從而可以推出繡球菌的菌絲硒耐受力為40mg/L。

從圖3可知，液體培養(yǎng)的菌絲體生長比較緩慢，但是可以看出在0～20mg/L的濃度下，其菌絲生長呈增長趨勢。

3.3 菌絲體富硒量變化 由圖4可知，固體培養(yǎng)的時候，不加硒的對照組含硒量為19.4mg/kg（干重），當(dāng)培養(yǎng)基含量為20mg/L時，菌絲體中硒的含量達(dá)到了最高24.17mg/kg；當(dāng)培養(yǎng)基中硒的濃度為40mg/L的時候，菌絲體中硒的含量為20.87mg/kg，而且隨著硒濃度的增加，菌絲體中硒元素的含量也隨之降低。

從圖5可知，液體培養(yǎng)的時候，當(dāng)培養(yǎng)基的含量為20mg/L時，繡球菌菌絲體的富硒量達(dá)到最高值45.5mg/kg。

3.4 富硒率 結(jié)合圖6、7可以看出，菌絲體的富硒率在20mg/L時最大為30.71%，當(dāng)培養(yǎng)基中硒的濃度高于40mg/L時，菌絲體的生長受到抑制，與不加硒元素培養(yǎng)基生長的繡球菌菌絲體相比，富硒能力也受到影響。

4 討論

作為人體內(nèi)必不可少的微量元素之一，硒元素是組成機體中磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶和紅細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶的必不可少的一部分，其主要的功能是參與酶的合成和保護(hù)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)不受到過度的干擾和氧化，除此之外，硒元素對于人體來說還有很多不可少的生理功能，對于保持機體的正常生命活動有重大意義。

目前對繡球菌富集硒元素的研究尚沒有太多的報道，對其他食用菌的富硒研究報道中最為常見的就是對富硒靈芝的研究，除了對食用菌的富硒研究外，還有對酵母、茶葉等的富硒研究。為此本研究以繡球菌為研究對象對其進(jìn)行了固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)富集硒元素的研究。

硒元素對繡球菌的菌絲體生長有著雙重作用，即促進(jìn)生長作用和抑制生長作用，在適宜的低濃度值內(nèi)硒元素有助于繡球菌菌絲體的生長，當(dāng)硒濃度值大于某一臨界值就會對繡球菌菌絲體的生長產(chǎn)生抑制作用。在本實驗中，加入亞硒酸鈉后，亞硒酸鈉作為無機硒被菌絲體吸收在機體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有機狀態(tài)下的硒，參加機體酶的轉(zhuǎn)化，加強繡球菌菌絲體內(nèi)的新陳代謝，使得體內(nèi)的蛋白質(zhì)量增加與硒元素結(jié)合。本實驗研究表明，繡球菌菌絲生長的耐受濃度為硒濃度為40mg/L的時候，此濃度相對于靈芝的富硒能力來說，繡球菌的硒元素的耐受能力相對較低。當(dāng)培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的含量達(dá)到20mg/L時，其富硒率達(dá)到最大值30.71%。當(dāng)硒濃度的含量超過40mg/L時，相對于正常培養(yǎng)的菌絲體來說，其富硒能力經(jīng)受到了抑制。

本次實驗過程中用到了繡球菌生長的最佳培養(yǎng)基，但繡球菌菌絲體的生長速度比較慢。由于其培養(yǎng)基對液體培養(yǎng)的觀察有妨礙作用，最后在其液體培養(yǎng)的時候采用了PDA培養(yǎng)基以便于觀察繡球菌菌絲的生長狀態(tài)。

消化的時候注意pH值的問題，需要在pH1.5～2.0的酸性條件下，用甲苯作為萃取劑，萃取鄰苯二胺與亞硒酸鈉發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成的絡(luò)合物，所以對實驗中pH的把握由為關(guān)鍵。調(diào)整pH時如果用10M的NaOH調(diào)值添加的量會比較多，實驗發(fā)現(xiàn)先加入3.5gNaOH顆粒，（下轉(zhuǎn)151頁）（上接125頁）然后再進(jìn)行調(diào)節(jié)。這樣會減少滴定工作的工作量，減小誤差，使溶液量基本保持一致。

該實驗精準(zhǔn)性的影響因素還有外來金屬離子的影響，如：銅、鐵等，這種情況只要加掩蔽劑EDTA-2Na即可消除，研究表明沒有加EDTA-2Na的樣品其吸光值比加了EDTA-2Na的高，證明EDTA確實對鐵等金屬干擾離子有屏蔽作用。但因為處理樣品時用的試劑環(huán)境有所差異，加入掩蔽劑的量就會有差異，要根據(jù)實際情況來決定加入EDTA的量。

5 結(jié)論

本實驗研究證明，亞硒酸鈉的濃度對繡球菌的生長有雙重作用，在40mg/L的亞硒酸鈉濃度以下對繡球菌生長有促進(jìn)作用，超過這個值就會有礙其正常生長。繡球菌對硒元素具有有效的富集能力，確定了培養(yǎng)基中的最佳硒添加濃度為20mg/L。此濃度下的繡球菌菌絲體的富硒量為45.5mg/kg，富硒率達(dá)到30.17%。

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（責(zé)編：張宏民）