21份引進BMR飼草高粱萌發(fā)期苗期耐旱耐鹽性評價

郝培彤，李玉龍，欒瑞濤，王建麗，王顯國

(1.中國農業(yè)大學草業(yè)科學系，北京 100193； 2.通遼星圣農業(yè)有限公司，內蒙古 霍林郭勒 029200；3.黑龍江省農業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 624400)

飼草高粱作為優(yōu)質飼草具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿等多種優(yōu)良特點，然而木質化程度高、消化率低是制約其飼喂效果不佳的主要因素之一。褐色中脈(brown midrib，BMR)突變體最早在玉米(Zeamays)研究中被報道[1]，隨后經人工誘導在高粱(Sorghumbicolor)[2]中獲得，褐色中脈指植株生長到4～6個擴展葉后，葉片中脈和莖髓有褐色色素沉著，隨成熟褐色沉著逐漸淡化，植株莖稈表皮呈淺褐色，髓呈紅褐色。BMR飼草高粱比普通飼草高粱木質素含量低40%～60%，能顯著提高消化率[3]。目前國內外對BMR高粱的研究主要集中在農藝性狀[4]、飼用價值[5-6]、遺傳分析[7-8]、生物燃料潛能[9]及抗逆性篩選[10]等方面。

高粱萌發(fā)期耐鹽性的鑒定濃度依供試材料不同而不同，有研究表明高粱最適耐鹽濃度為100～205 mmol·L-1NaCl[11-12]，耐旱性鑒定可用不同濃度的PEG-6000進行[13]，但研究材料多為甜高粱、雜交高粱、地方種質材料等，而以BMR高粱為研究對象進行耐旱、耐鹽性系統(tǒng)評價的研究較少，且萌發(fā)期和苗期的耐旱、耐鹽性并不完全相同，所以系統(tǒng)研究BMR高粱的萌發(fā)期、苗期耐旱、耐鹽性尤為重要。本研究選用的21份BMR飼草高粱不育系材料均為國內首次引進，通過隸屬函數(shù)值法綜合評價耐旱耐鹽性，為上述引進材料在我國飼草高粱育種實踐中的高效利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的21份種質材料引自美國，均為BMR飼草高粱不育系[14]，試驗材料BMP446、BMP447、BMP448、BMP449、BMP450、BMP451、BMP452、BMP453、BMP454、BMP455、BMP456、BMP12、BMP14、BMP15、BMP16、BMP17、BMP18、BMP19、BMP20、BMP21均來自密西西比州立大學，Tift98bmrB1來自美國農業(yè)部農業(yè)研究局GEORGIA試驗站，按順序依次編號為1-21。

1.2 試驗設計

1.2.1萌發(fā)期耐旱性、耐鹽性評價 選成熟、飽滿、均勻一致的種子，用0.5%次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3次。隨機選8份材料在0(CK)、150、200、300、400 mmol·L-1NaCl及5%、10%、15%、20% PEG-6000進行預試驗，分析得到在300 mmol·L-1NaCl、20% PEG脅迫下各材料間差異最顯著，因此正式試驗鹽脅迫用300 mmol·L-1NaCl，干旱脅迫為20% PEG-6000溶液。紙上發(fā)芽法每皿100粒，每皿加相應鹽溶液或PEG溶液10 mL，對照加10 mL蒸餾水，每處理4次重復，光照培養(yǎng)箱28 ℃/25 ℃(12 h/12 h)、濕度60%變溫條件下培養(yǎng)。稱重法每天補水，初次計數(shù)為第2天，發(fā)芽周期為10 d。為消除試驗材料間的差異均采用各項指標的相對值來表示材料的抗性。

1.2.2苗期耐旱性、耐鹽性評價 2016年12月29日采用沙培法將材料播種于育苗盤，溫室培養(yǎng)，保證每育苗盤每份材料出苗20株以上，每處理育苗盤重復4次。前期正常澆水(田間持水量70%～80%)、除草管理，三葉期時開始進行鹽脅迫，將育苗盤置于托盤中，托盤中加入等量鹽溶液，每24 h更換一次鹽溶液，分別用0、150、300 mmol·L-1NaCl脅迫7 d后，統(tǒng)一在08:00-09:00采集葉片。為了避免造成鹽沖擊，NaCl濃度由每24 h增加50 mmol·L-1直至試驗濃度。干旱脅迫幼苗正常澆水(田間持水量70%～80%)至三葉期，以正常澆水1 d后作為脅迫起始點，分別在1 d(CK)、4 d(實測為田間持水量50%～55%)、7 d(實測為田間持水量25%～35%)08:00-09:00采集葉片。

1.3 測定指標

1.3.1萌發(fā)期形態(tài)指標

發(fā)芽率(GP)=(G/N)×100%。

式中：G為正常發(fā)芽的種子數(shù)；N為供試種子總數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt。

式中：Gt為在時間t時的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=S×GI。

式中：S為幼苗的芽長。

根長(RL)：處理結束時，用直尺測定從種子胚到最長根尖的長度。芽長(BL)：處理結束時，用直尺測定從種子胚到最長葉尖的長度。

相對值=(各指標處理值/對照值)×100%。

1.3.2苗期生理指標 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)[15]法測定；過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定[16]；過氧化物酶(POD)活性的測定：采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]。

1.4 綜合評價方法

利用模糊數(shù)學中的隸屬函數(shù)值法將上述各指標進行抗鹽、抗旱綜合評價。當性狀指標與抗性正相關時，式中:Xij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)；當性狀指標與抗性負相關時，公式為:Xij=1-(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)；Xij表示i種類j指標的抗性隸屬函數(shù)值；xij表示i種類j指標的測定值；隸屬函數(shù)值xi=1/n ∑xij，xi越大則抗性越強。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及 DUNCAN 法多重比較；Excel 2013制作圖表。

2 結果與分析

2.1 耐旱性評價

20%PEG干旱脅迫對21種供試材料形態(tài)指標影響各不相同(表1)，干旱脅迫促進了BMP20、BMP448、BMP12的相對發(fā)芽率，Tift98bmrB1、BMP453、BMP18、BMP446相對發(fā)芽率顯著降低(P<0.05)。除BMP12發(fā)芽指數(shù)比對照增加外，干旱脅迫均抑制其他材料相對發(fā)芽指數(shù)， BMP454、BMP450、Tift98bmrB1、BMP18相對發(fā)芽指數(shù)受到顯著抑制(P<0.05)；干旱脅迫顯著增加BMP14、BMP19、Tift98bmrB1根長，顯著增加BMP17、BMP456、BMP447芽長(P<0.05)；除BMP17活力指數(shù)增加外，其他材料活力指數(shù)均被抑制，BMP18、Tift98bmrB1受到抑制程度最大，相對活力指數(shù)僅為38.04%。

20% PEG干旱脅迫下POD活性呈上升趨勢，隨脅迫時間的增加，供試材料POD活性有增高也有下降，材料BMP455對重度干旱響應最快，其POD活性顯著高于其他材料(P<0.05)(圖1)。SOD活性隨干旱脅迫增加有增加有減少，BMP446、BMP448、BMP12、BMP456對干旱脅迫響應快且最終含量較高。BMP17、BMP18、BMP14、Tift98bmrB1隨干旱脅迫天數(shù)增加其SOD活性均降低(圖1)。干旱脅迫下CAT活性除BMP14之外其他材料都呈上升趨勢，BMP14在重度干旱下CAT含量最低(圖1)。

表1 20%PEG干旱脅迫下不同材料的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對根長、相對芽長、相對活力指數(shù)Table 1 The relative germination rate, relativegerminationindex, relative root length, relative bud length and relativevigorindex of materials under 20%PEG drought stress

同列不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among treatments at the 0.05 level．

圖1 干旱脅迫天數(shù)對不同材料苗期POD、SOD、CAT的影響Fig. 1 Effect of drought stress on POD, SOD, and CAT contents of materials during the seedling stage

不同小寫字母表示同一時間不同材料間差異顯著(P<0.05)。1-21分別表示BMP446，BMP447，BMP448，BMP449，BMP450，BMP451，BMP452，BMP453，BMP454，BMP455，BMP456，BMP12，BMP14，BMP15，BMP16，BMP17，BMP18，BMP19，BMP20，BMP21，Tift98bmrB1，圖2同。

Different lowercase letters indicate significant difference among different materials at the 0.05 level．1-21 indicate BMP446，BMP447，BMP448，BMP449，BMP450，BMP451，BMP452，BMP453，BMP454，BMP455，BMP456，BMP12，BMP14，BMP15，BMP16，BMP17，BMP18，BMP19，BMP20，BMP21， Tift98bmrB1, respectively; similarly for the Fig. 2.

2.2 耐鹽性評價

300 mmol·L-1鹽脅迫下，BMP20、BMP453發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均高于其他材料(表2)；BMP12、BMP449與對照比發(fā)芽率降低； BMP14、BMP15發(fā)芽率顯著降低(P<0.05)。BMP14、BMP447、BMP15發(fā)芽指數(shù)顯著降低；BMP14、BMP454、BMP447、BMP456、BMP21的芽長； BMP21、BMP454、BMP15活力指數(shù)顯著降低；300 mmol·L-1鹽脅迫對BMP447、BMP14抑制作用最大。

鹽脅迫下POD活性升高，隨脅迫程度增加BMP455、BMP15、BMP16的POD活性快速增加，而BMP448、BMP17則增加緩慢；Tift98bmrB1、BMP14的POD顯著下降(P<0.05)(圖2)。隨鹽脅迫程度增加，BMP446、BMP449、BMP16 SOD活性對鹽脅迫響應快且迅速增加，其中，BMP446、BMP16 SOD活性增加至最大且顯著高于其他材料，而Tift98bmrB1、BMP14、BMP18 SOD活性較小(圖2)。鹽脅迫程度增加呈上升趨勢，BMP451、BMP15在高鹽脅迫下處于較高水平，但兩者間差異不顯著(P<0.05)；高鹽脅迫下，BMP14 CAT活性最低(圖2)。

2.3 抗性綜合評價

將供試材料萌發(fā)期、苗期各指標經隸屬函數(shù)值法分析后發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)期耐旱性較強的為BMP17、BMP448、BMP12，耐旱性較差的為Tift98bmrB1、BMP18、BMP453；苗期耐旱性較強的為BMP456、BMP448、BMP12；萌發(fā)期耐鹽性較強的為BMP16、BMP453，而最差的為BMP14，苗期耐鹽性較強為BMP455、BMP456、BMP16，而最差為BMP14(表3)。

表2 300 mmol·L-1鹽脅迫下不同材料的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對根長、相對芽長、相對活力指數(shù)Table 2 The relative germination rate， relative germination index， relative root length，relative bud length and relative vigor index of materials under 300 mmol·L-1NaCl salt stress

圖2 NaCl脅迫處理對不同材料苗期POD、SOD、CAT的影響 Fig. 2 Effect of salt stress on POD (a), SOD (b), and CAT (c) content of materials during the seedling stage

3 討論

干旱鹽堿地區(qū)水分、鹽分成為限制種子萌發(fā)的主要因素，萌發(fā)期是植物對鹽脅迫、干旱脅迫最敏感的時期[17]，植物在萌發(fā)和苗期的抗逆性可以反映該物種的抗逆性[18-19]。研究表明，低濃度NaCl脅迫可促進隴東達烏里胡枝子(Lespedezadavurica)發(fā)芽率，但高濃度鹽脅迫顯著抑制胡枝子發(fā)芽率、根長及芽長；低濃度PEG可促進隴東達烏里胡枝子、科爾沁尖葉胡枝子的發(fā)芽率及胚根生長[20]，在甜高粱“凱勒”、“MN-94”發(fā)芽率上也得到相同結果[12]。本研究表明20% PEG-6000、300 mmol·L-1NaCl脅迫可促進某些耐旱耐鹽材料的種子萌發(fā)，300 mmol·L-1NaCl脅迫可促進耐鹽材料BMP20、BMP453的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，抑制不耐鹽材料BMP14芽長及活力指數(shù)；20%PEG處理下抗旱較強的材料BMP14、BMP19、Tift98bmrB1根長顯著增加， BMP17、BMP456、BMP447的芽長顯著增加；除BMP17外，PEG脅迫均抑制供試材料的活力指數(shù)，說明一定濃度鹽、旱脅迫可提高抗逆性強的種子的萌發(fā)及種子活力，對抗性弱的種子活力產生一定阻礙作用，減緩其萌發(fā)速率，這與甜高粱在鹽旱脅迫下發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)降低結果一致[12]。

表3 供試材料耐旱性、耐鹽性相對隸屬函數(shù)值Table 3 Relative subordinate values of experiment materialsunder drought and salt stress

鹽脅迫對植物造成的傷害包括原初傷害和次生鹽害兩部分，前者是指鹽離子滲入造成的細胞及植物體代謝紊亂；而后者指鹽脅迫產生的離子脅迫和滲透脅迫進而引發(fā)氧化脅迫，導致植物的生理干旱。逆境時植物通過產生抗氧化酶SOD、POD、CAT、GSH、APX等清除體內多余活性氧，通過游離脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調節(jié)物質變化來維持調節(jié)機體內活性氧平衡，當脅迫超過植物耐受極限時，機體防御系統(tǒng)破壞，保護酶活性下降[21-22]。研究表明，花花柴(Kareliniacaspia)幼苗葉片在鹽旱脅迫下短時間內SOD、POD、CAT活性呈上升趨勢，隨脅迫濃度增加及脅迫時間的延長，細胞代謝紊亂，保護酶失活，活性氧清除能力降低最終導致細胞死亡[23]；同樣在NaCl脅迫下燕麥(Avenasativa)體內SOD、POD活性也表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢[24]。本研究表明，鹽旱脅迫下BMR高粱SOD活性先增加以清除體內的活性氧，隨脅迫程度增加抗性強的材料能快速響應并產生更多SOD酶以減弱逆境對植物體的傷害，但抗性較差的材料可能由于超過耐受極限代謝紊亂而SOD活性下降，POD活性隨脅迫程度增加趨勢同SOD活性趨勢相似，CAT活性則表現(xiàn)為隨脅迫程度增加呈上升趨勢。

4 結論

21份BMR飼草高粱萌發(fā)期耐旱性較強的材料為BMP17、BMP448、BMP12、BMP19、BMP456、BMP14、BMP20、BMP21，耐旱性較弱的為Tift98bmrB1、BMP18、BMP453，耐旱性中等的為BMP14等10個材料；苗期耐旱性較強的為BMP456、BMP448、BMP12、BMP455，耐旱性較弱的為BMP452、BMP17、BMP447、BMP14，耐旱性中等的為BMP15等13個材料。

萌發(fā)期耐鹽性較強的為BMP16、BMP453、BMP12、Tift98bmrB1、BMP20，耐鹽性較弱的為BMP447、BMP15、BMP14、BMP454，耐鹽性中等的為BMP455等12個材料；苗期耐鹽性較強的為BMP455、BMP456、BMP15、BMP16、BMP446、BMP452，耐鹽性較弱的為Tift98bmrB1、BMP14，耐鹽性中等的為BMP12等13個材料。

綜上，萌發(fā)期、苗期耐旱性均較強的材料為BMP12、BMP456、BMP448；萌發(fā)期、苗期耐鹽性均較強的材料為BMP16、BMP12、BMP453。

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