不同紫花苜蓿雜交組合對凍害脅迫的生理響應(yīng)

陳晶晶，王英哲，金 艷，郭 強(qiáng)，徐 博

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130118)

吉林省位于121°38′-131°19′ E，40°52′-46°18′ N，地處東北亞地區(qū)腹地，屬溫帶季風(fēng)性氣候，土壤肥沃，全省大部地區(qū)年平均氣溫為3～5 ℃，年均活動(dòng)積溫為2 700～3 600 ℃·d[1]，年均氣溫過低是導(dǎo)致吉林省紫花苜蓿(Medicagosativa)越冬率偏低的主要因素。紫花苜蓿是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，具有適口性好，營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，在畜牧業(yè)中有舉足輕重的地位[2]。凍害是影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)的非生物脅迫之一，外界環(huán)境溫度過低會(huì)影響植物生長發(fā)育、生理和光合特性[3]，植物體的生理生化指標(biāo)也會(huì)隨著冬季溫度的降低而呈現(xiàn)不同的變化，植株的抗寒力也會(huì)逐步提高[4]。我國東北地區(qū)和廣大山區(qū)冬季寒冷且持續(xù)時(shí)間長，引進(jìn)篩選一些抗寒性強(qiáng)，適宜該區(qū)域種植的牧草種質(zhì)資源，對該區(qū)域發(fā)展畜牧業(yè)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要的意義[5]。為了研究紫花苜蓿在凍害脅迫下的生理特性變化規(guī)律，通過模擬冬季低溫環(huán)境[6]，設(shè)置抗寒鍛煉階段對紫花苜蓿進(jìn)行冷凍處理，綜合評價(jià)各個(gè)雜交組合的抗寒性，旨在篩選出適合高寒條件下生長的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供的20個(gè)不同品種的紫花苜蓿為父本，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的MS-GN為母本構(gòu)建的雜交組合，隨機(jī)選擇性狀優(yōu)良的父本10-7481、05-1215、11-8540、11-8502、05-11535的5個(gè)雜交組合為研究材料，并分別編號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ進(jìn)行凍害脅迫。試驗(yàn)地處吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，于2017年5月24日將營養(yǎng)土滅菌，每個(gè)育苗器內(nèi)播種6粒種子，每個(gè)雜交組合各種3份，做好標(biāo)記后移至HPG-400HX人工氣候箱培養(yǎng)(光照12 000 lx，15 h，溫度25 ℃,濕度75%；無光照，9 h，溫度20 ℃,濕度75%)，2周后，再移到實(shí)驗(yàn)室陽光充足的地方室溫培養(yǎng)2周；將苗期苜蓿連同育苗器移栽至盛有相同營養(yǎng)土的花盆中，花盆高15 cm、口徑10 cm，做好標(biāo)記，培養(yǎng)30 d。

2017年7月24日開始進(jìn)行抗寒鍛煉：20 ℃/15 ℃(15 h/9 h)、15 ℃/10 ℃(15 h/9 h)、10 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、5 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、0 ℃/0 ℃(15 h/9 h)；冷凍階段：-15 ℃/-20 ℃(15 h/9 h)；返青階段：5/5 ℃解凍后，10 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、15 ℃/10 ℃(15 h/9 h)、20 ℃/15 ℃(15 h/9 h)、25 ℃/20 ℃(15 h/9 h,培養(yǎng)7 d)觀察返青數(shù)。同時(shí)以25 ℃/10 ℃(15 h/9 h)作為對照組；各階段最后一天取樣測定脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)。

1.2 指標(biāo)測定及方法

本研究所采用的試劑盒統(tǒng)一購買于南京建成生物工程研究所。

1.2.1植物組織液的提取 稱取0.150 0 g幼苗的新鮮葉片剪碎，加入0.05 mol·L-1、pH 7.8的磷酸緩沖液1.5 mL及少量的石英砂于研缽中研磨，移至2 mL離心管中，5 000 r·min-1、4 ℃下離心10 min，取上清液，用于指標(biāo)測定。

1.2.2SOD活性的測定 采用抽提法測定SOD活性[7]。

1.2.3MDA含量的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[7]，使用試劑盒，測定532 nm下的OD值。

1.2.4SS含量的測定 采用蒽酮比色法測定植物可溶性糖含量，在620 nm下比色，測定吸光度值[7]。

1.2.5SP含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定，首先，用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；其次，吸取組織液0.2 mL，加入2 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混勻，靜置5 min后，在595 nm的波長下測定OD值，通過制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.6Pro含量的測定 采用酸性茚三酮法測定Pro含量[7]。

1.3 綜合評價(jià)方法

采用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評判[8-10]。

與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)SP、SS、SOD、Pro采用公式：

(1)

與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)MDA采用公式:

(2)

式中：Xijk表示第i個(gè)品種第j個(gè)處理下的第k個(gè)指標(biāo)的測定值；U(Xijk)表示第i個(gè)品種第j個(gè)處理下的第k個(gè)指標(biāo)的隸屬度，且U(Xijk)∈[0,1]；Xmin、Xmax表示測定值中的最小值和最大值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Excel作圖，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 返青情況

經(jīng)過低溫脅迫，植物解凍恢復(fù)生長7 d后的返青苗數(shù)除以每個(gè)雜交組合的總苗數(shù)(18株)，即為返青率，各雜交組合返青情況為Ⅴ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ>Ⅳ。

表1 各雜交組合返青情況Table 1 The rate of turning green of alfalfa hybrid combination

2.2 可溶性蛋白含量變化

供試材料可溶性蛋白含量總體趨勢是升高的(圖1)，在返青階段，外界溫度回升時(shí)可溶性蛋白含量顯著高于其他階段(P<0.05)，達(dá)到最大值，分別為1.591、1.593、1.592、1.595和1.594 mg·g-1。Ⅱ號雜交組合在冷凍階段可溶性蛋白含量為1.459 mg·g-1，較抗寒鍛煉階段的1.464 mg·g-1有所降低，且降幅顯著(P<0.05)，但與對照組1.268 mg·g-1相比顯著增長(P<0.05)，其余雜交組合各階段的可溶性蛋白含量與對照相比均顯著增長(P<0.05)。

2.3 超氧化物歧化酶活性變化

不同雜交組合SOD的活性總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖2)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ號雜交組合在冷凍階段的SOD活性顯著高于其他各階段，達(dá)到最大值分別為22.201、22.907、22.986和21.989 U·(mg·min)-1；返青階段SOD活性分別為17.411、16.488、16.414和15.893 U·(mg·min)-1均顯著低于冷凍階段(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號雜交組合返青階段SOD活性分別為：17.411、16.488、16.414和18.242 U·(mg·min)-1均顯著低于抗寒鍛煉,抗寒階段分別為21.658、22.317、19.676和21.138 U·(mg·min)-1。Ⅴ號雜交組合對照組SOD活性為10.365 U·(mg·min)-1顯著低于其他3組的SOD活性(P<0.05)。

2.4 可溶性糖含量變化

不同雜交組合在經(jīng)過凍害脅迫后，植物體內(nèi)可溶性糖的含量總體呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(圖3)。每個(gè)雜交組合抗寒鍛煉階段的可溶性糖含量均最小，顯著低于其他各階段(P<0.05)，分別為1.643、3.314、2.680、0.580和5.040 mg·g-1；冷凍階段的含量顯著高于對照組及其他各階段(P<0.05)，達(dá)到最大值為6.828、6.807、7.387、5.706和6.140 mg·g-1；返青階段的含量分別為4.847、6.060、5.354、5.325和5.257 mg·g-1顯著高于對照組的4.524、4.878、3.893、2.220和5.142 mg·g-1(P<0.05)，且顯著低于冷凍階段(P<0.05)。

圖1 凍害脅迫對供試材料可溶性蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of freezing injury on the soluble protein content of alfalfa

不同字母表示不同處理間差異顯著 (P<0.05)。Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ同表1，下同。

Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level; Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴare the same as Table 1; similarly for the following figures．

圖2 低溫脅迫下對供試材料超氧化物歧化酶活性的影響Fig. 2 Effect of freezing injury on the SOD activities of alfalfa

圖3 凍害脅迫下對供試材料可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effect of freezing injury on the soluble sugar content of alfalfa

2.5 脯氨酸含量的變化

各雜交組合植株體內(nèi)脯氨酸的含量變化總體表現(xiàn)為升高的趨勢(圖4)。Ⅰ號雜交組合冷凍階段脯氨酸含量40.483 μg·g-1顯著高于其他各階段(P<0.05)，且返青階段脯氨酸含量35.222 μg·g-1顯著高于對照組15.334 μg·g-1及抗寒鍛煉階段19.760 μg·g-1(P<0.05)；Ⅱ號雜交組合抗寒鍛煉階段脯氨酸含量為35.479 μg·g-1略低于對照組35.672 μg·g-1(P>0.05)，并且顯著低于冷凍階段39.072 μg·g-1及返青階段58.447 μg·g-1(P<0.05)，返青階段顯著高于其他各組(P<0.05)，達(dá)到最大值58.447 μg·g-1；Ⅳ號雜交組合冷凍階段脯氨酸含量顯著高于其他階段(P<0.05)，達(dá)到最大值53.956 μg·g-1，抗寒鍛煉階段脯氨酸含量32.977 μg·g-1略低于對照組33.811 μg·g-1(P>0.05)。Ⅲ、Ⅴ號雜交組合脯氨酸含量隨著溫度的改變而逐步升高，返青期最高。

2.6 丙二醛含量的變化

各雜交組合體內(nèi)MDA含量總體呈增加的趨勢(圖5)。各雜交組合返青階段MDA含量顯著高于其他各階段(P<0.05)，分別為0.607、0.586、0.506、0.620和0.665 nmol·g-1。抗寒鍛煉階段Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的雜交組合丙二醛含量為0.290、0.160和0.413 nmol·g-1，低于對照組，對照組含量0.300、0.181和0.422 nmol·g-1，但降幅不顯著(P>0.05)。各雜交組合冷凍階段MDA含量0.395、0.500、0.432、0.454和0.509 nmol·g-1，返青階段MDA含量0.607、0.586、0.506、0.6201和0.665 nmol·g-1均顯著高于對照組，對照組MDA含量0.142、0.300、0.181、0.111和0.422 nmol·g-1(P<0.05)。

2.7 抗寒性綜合評價(jià)

本研究利用Fuzzy數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，求得各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，對5個(gè)雜交組合抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)，結(jié)果表明，抗寒性由強(qiáng)至弱的雜交組合依次是Ⅴ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ>Ⅳ。

圖4 凍害脅迫下對供試材料脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effect of freezing injury on the proline content of alfalfa

圖5 凍害脅迫下對供試材料丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of freezing injury on the MDA content of alfalfa

3 討論與結(jié)論

凍害是牧草在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)遇到的自然災(zāi)害之一，不僅限制了牧草的生長發(fā)育，也影響了牧草的產(chǎn)量及品質(zhì)。紫花苜蓿的越冬問題已成為制約我國北方苜蓿草地成功建植和草地可持續(xù)利用的關(guān)鍵問題之一[11]。在凍害脅迫下，植物體會(huì)產(chǎn)生一系列反應(yīng)來抵抗不良環(huán)境，從而保證自身的生長發(fā)育?？扇苄蕴?、可溶性蛋白和脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是植物抗寒性鑒定的生理指標(biāo)之一[12]。凍害脅迫下植物體內(nèi)會(huì)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。整個(gè)試驗(yàn)過程中，可溶性蛋白含量增幅較為明顯，恢復(fù)生長后其含量仍顯著高于對照，這是由于可溶性蛋白具有較高的親水性，可增加細(xì)胞保水能力[11]，溫度過低會(huì)通過增加可溶性蛋白的含量來增強(qiáng)抗寒性，從而保護(hù)自身。由可溶性蛋白的隸屬函數(shù)值可以看出Ⅳ號雜交組合的可溶性蛋白含量最高，Ⅰ號雜交組合最低，表明Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號雜交組合抵御凍害脅迫的能力強(qiáng)于Ⅰ、Ⅱ號雜交組合。植物體內(nèi)脯氨酸是細(xì)胞質(zhì)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[13]，隨著外界溫度的降低，脯氨酸含量逐漸升高，植物通過增加脯氨酸的含量降低質(zhì)膜受凍害的程度，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在冷凍階段的脯氨酸升高幅度明顯大于Ⅱ、Ⅴ，說明此時(shí)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ具有較強(qiáng)的抗寒性，植物通過增加脯氨酸含量來提高抗寒性，這與馮昌軍等[14]、李軼冰等[5]的研究結(jié)果一致。隨著溫度降低，可溶性糖含量顯著升高，這是由于當(dāng)植物遭受凍害脅迫時(shí)，糖可以提高細(xì)胞液濃度，降低冰點(diǎn)，緩和細(xì)胞質(zhì)過度脫水，保持細(xì)胞不致遇冷凝固，從而提高植物抗寒性[11]，這與鄧仁菊等[12]的研究結(jié)果一致。本研究的5個(gè)供試材料隨著溫度降低，可溶性糖含量均顯著升高，但Ⅲ、Ⅳ以兩倍的增長幅度大于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ，說明Ⅲ、Ⅳ耐寒能力較強(qiáng)。綜合3項(xiàng)生理指標(biāo)，各雜交組合的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均隨著溫度的降低而升高，此外表明Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ雜交組合的抵抗凍害脅迫的能力強(qiáng)于Ⅰ、Ⅱ。

MDA是植物在逆境脅迫下對細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平的一種反應(yīng)[15]。隨著溫度的降低MDA在植物體內(nèi)的含量逐漸升高，說明此時(shí)質(zhì)膜過氧化程度降低，植物表現(xiàn)出了抗寒性。寒冷脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)MDA的積累，在張尚雄等[16]的研究中也得到了相同的觀點(diǎn)。所以僅從MDA這一項(xiàng)指標(biāo)判斷，Ⅱ、Ⅴ號雜交組合具有較強(qiáng)的抗寒性，而Ⅳ號雜交組合的抗寒性較弱。

SOD是植物重要的耐冷保護(hù)酶系統(tǒng)[17]，當(dāng)植物受到凍害脅迫時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)不同的SOD基因表達(dá)，以清除體內(nèi)活性氧，保持細(xì)胞內(nèi)活性氧與防御系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡[18]。隨著溫度的降低各雜交組合SOD活性與對照相比顯著升高，這表明SOD在清除體內(nèi)活性氧，防止細(xì)胞受損，抵抗低溫傷害有著重要作用。當(dāng)溫度回升，體內(nèi)活性氧減少，SOD含量也隨之降低。因此，Ⅴ號雜交組合在受到凍害脅迫時(shí)，SOD活性增幅最大，說明Ⅴ號雜交組合具有較強(qiáng)的抗寒性。

綜合5個(gè)雜交組合在各溫度階段生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，求得平均值，結(jié)果表明抗寒性由強(qiáng)至弱的雜交組合是：Ⅴ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ>Ⅳ，雖然這與返青情況一致，但返青情況卻不一定能說明抗寒性的強(qiáng)弱，卻可作為判斷依據(jù)之一。同時(shí)，該結(jié)果與上述以單一指標(biāo)作為判斷依據(jù)時(shí)，所得到的抗寒性強(qiáng)弱結(jié)果略有出入，但這也說明了，植物抗寒性不是由單一的某一個(gè)指標(biāo)決定，而是植物體內(nèi)多個(gè)生理因素共同作用的結(jié)果，抗寒性評價(jià)結(jié)果受不同生理生化指標(biāo)的綜合影響[19-20]。選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的抗寒性牧草品種在高寒牧區(qū)種植推廣，可有效緩解高寒牧區(qū)冬春季的飼草缺乏現(xiàn)狀[21]。本研究篩選出以05-11535、11-8540為父本的雜交組合適于推廣至高寒地區(qū)，同時(shí)可提高高寒地區(qū)紫花苜蓿的產(chǎn)量與品質(zhì)，為紫花苜蓿品種選育提供理論基礎(chǔ)。

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