微白黃鏈霉菌對紅豆草殼二孢的拮抗效果評價

曹 師,史 敏,李彥忠,2

(1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)是豆科(Leguminosae)紅豆草屬多年生牧草，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，飼草和種子都含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。有“牧草皇后”之稱[2]的紅豆草其飼用價值可與“牧草之王”紫花苜蓿(Medicagosativa)相媲美。然而病害是紅豆草生長和生產(chǎn)的重要限制因素，植株染病后可嚴重影響種子質(zhì)量和植株的生物量[3-4]。在我國由紅豆草殼二孢(Ascochytaonobrychidis)引起的葉斑與黑莖病是紅豆草生最為常見的一種病害，主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅和新疆等地[5]；同時該病在國外也分布廣泛，主要分布在歐洲，不同的是在國外紅豆草上的殼二孢被報道為蠶豆殼二孢(A.fabae)[6]和歪頭菜殼二孢(A.orobi)[7]。 該病原寄主范圍廣，侵染力強，植株的葉、莖和莢果均可被侵染[8]，以莖葉部為主，葉部病斑多出現(xiàn)于葉片中間或側(cè)緣，病斑近圓形，邊緣深褐色；在葉柄和莖稈上病斑梭形、橢圓形或不規(guī)則的大斑，邊緣黑色，發(fā)生嚴重的植株，病變部相連使葉柄和莖稈大部分表面變黑，植株受害后，嚴重影響紅豆草的生產(chǎn)。

生產(chǎn)上防治紅豆草殼二孢葉斑與黑莖病主要依賴于抗病品種的選育和化學殺菌劑拌種等手段[5,8]。這些措施均有各自的弊端，抗病品種的選育周期長、成本高；長期使用化學試劑一方面容易產(chǎn)生耐藥性菌株，另一方面對環(huán)境造成污染，破壞生態(tài)系統(tǒng)，威脅人畜安全[9]。近年來生物防治的高效、無毒無害、無污染、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點不僅保證了生態(tài)安全，而且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障，因此生物防治也越來越受到重視。Wakelin等[10]從土壤分離得到的細菌芽孢桿菌(Bacillus)在室內(nèi)和田間均對豌豆根腐絲囊霉(Aphanomyceseuteiches)有很強的抑菌效果；Wharton等[11]用分離得到的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)菌液處理馬鈴薯(Solanumtuberosum)種子后，能夠顯著降低馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率；Gopalakrishnan等[12]分離得到的5株放線菌菌株在溫室和田間條件下均對鐮刀菌起到良好的抑制效果。為探索紅豆草殼二孢葉斑和黑莖病的生物防治途徑，本研究以從紅豆草莖部分離得到的拮抗放線菌株為材料，以紅豆草殼二孢為指示病原，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析對該拮抗菌株進行分類地位的確定和拮抗作用的初探，旨在為紅豆草殼二孢葉斑與黑莖病的生物防治研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：放線菌LYZ0255分離自紅豆草莖部；紅豆草殼二孢葉斑病致病菌Ascochytaonobrychidis分離于甘肅地區(qū)栽培紅豆草染病植株。

培養(yǎng)基：放線菌菌株的活化和培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基；放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基參照范麗霞[13]篩選的小米培養(yǎng)基1 000 mL：小米1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.25%，CaCO30.1%，(NH4)2SO40.1%，紅豆草殼二孢葉斑病菌的分離和培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dexterous agar medium,PDA)培養(yǎng)基。

1.2 菌種鑒定

1.2.1形態(tài)學觀察 依照閻遜初[14]的方法，將拮抗放線菌劃線接種在高氏一號培養(yǎng)基，采用插片培養(yǎng)法，在接種點斜45 ℃插入滅菌的蓋玻片，28 ℃培養(yǎng)1周后取出蓋玻片在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

用革蘭氏染色觀察：挑取少許待測菌株置于滴有蒸餾水的載玻片上涂片，通過火焰3次固定。加結(jié)晶紫染色1 min，水洗；加碘液染色1 min，水洗；加95%的酒精，脫色30～60 s，水洗，吸干水分；加番紅復染1 min，水洗。吸干或在空氣中晾干后，用油鏡鏡檢，觀察菌株形態(tài)特征[15]。

1.2.2培養(yǎng)特征和生理生化特性研究 將待鑒定菌株分別接種在高氏一號、克氏一號、察氏瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、葡萄糖酵母膏瓊脂、淀粉瓊脂等培養(yǎng)基和馬鈴薯塊上[16]，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在7、14和28 d觀察并記錄氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和可溶性色素的顏色變化。取穩(wěn)定期的顏色特征為期培養(yǎng)特征和定種依據(jù)。生理生化特性研究：參照周德慶[17]和《鏈霉菌鑒定手冊》中所描述的方法，采用明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素水解、硫化氫的產(chǎn)生和碳源利用試驗進行待測菌株的生理生化特性測定，測定結(jié)果與文獻中所描述標準菌株的生理生化特性進行比對[16,18]。

1.2.316S rDNA序列擴增與分析 待測菌株基因組的提取采用OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒，按照說明書的步驟進行操作。16S rDNA序列擴增采用細菌通用引物1429R(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和27F(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)由上海生工生物工程技術(shù)服務公司合成[19]。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增采用20 μL的反應體系，包括ddH2O 8.5 μL，Taq酶 10 μL，引物1429R和27F各0.5 μL，DNA模板0.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序。將獲得序列在EzBioCloud的EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，下載與待測菌株序列同源性相近的模式菌株序列，利用MEGA6.0軟件采用Neighbor-Joining(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3 抑菌效果測定

1.3.1平板對峙試驗 用直徑5 mm的打孔器將紅豆草殼二孢病原菌塊接種于PDA培養(yǎng)皿中心，同時用滅菌的接種針挑取單菌落放線菌接種于距病原菌3 cm處，每皿點接4個供試菌株，各點位置成十字形[21]；以只接種紅豆草殼二孢菌塊的處理為對照，每個處理5個重復，22 ℃下培養(yǎng)，待對照長滿全皿時，記錄菌落直徑，按照如下公式計算相對抑制率。

相對抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100% 。

1.3.2放線菌LYZ0255無菌發(fā)酵液的制備 在裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中轉(zhuǎn)接兩個放線菌菌餅(直徑5 mm，活化4 d)，在28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d。將帶菌發(fā)酵液在無菌環(huán)境下取適量裝入滅菌的50 mL離心管中，在4 ℃、8 000 r·min-1下離心15 min，去沉淀，上清液用0.22 μm細菌過濾器過濾，即得含放線菌菌株的無菌發(fā)酵液(Actinomyces sterile fermentation broth,A-SFB )；同樣條件下未接種放線菌的液體培養(yǎng)基制成不含放線菌的無菌發(fā)酵液(sterile fermentation broth,SFB)，得到兩種無菌發(fā)酵濾液保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3LYZ0255無菌發(fā)酵液對病菌菌絲生長的抑制作用測定 分別取1 mL備用的A-SFB、SFB和無菌水與9 mL無菌PDA混勻，制成含有A-SFB、SFB和無菌水的平板培養(yǎng)基(無菌水平板作為對照)，用直徑5 mm的打餅器取生長狀況一致的紅豆草殼二孢菌餅轉(zhuǎn)移至各培養(yǎng)基中央，在22 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理5個重復，待對照長滿全皿時，記錄菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，方法同1.3.1。

1.3.4LYZ0255無菌發(fā)酵液對病菌孢子萌發(fā)抑制作用測定 采用凹片法，分別吸取100 μL的A-SFB、SFB和無菌水加入到凹形載玻片中的凹槽中，再吸取等量的濃度為1×106個·mL-1紅豆草殼二孢孢子懸浮液加入到上述凹玻片的凹槽中，將混合的凹載玻片放入到有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中22 ℃培養(yǎng)，12 h后檢查孢子萌發(fā)情況，每個處理3個重復，每個重復顯微鏡下觀察5個視野，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，計算孢子萌發(fā)抑制率[22]。

孢子萌發(fā)抑制率=[(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對照萌發(fā)率]×100% 。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1菌落和形態(tài)特征 在高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫條件下該手拮抗菌生長良好，菌落黃白色(圖1A)；基內(nèi)菌絲無色，無隔不斷裂；氣生菌絲蛛網(wǎng)灰色，呈樹杈狀分支(圖1B)；孢子絲鉤狀，頂端螺旋形(圖1C)，孢子圓形或卵圓形。

拮抗菌株在大多數(shù)培養(yǎng)基上可產(chǎn)生可溶性色素，顏色呈黃白色、琥珀色或微黃白色，僅在察氏瓊脂培養(yǎng)基上無可溶性色素產(chǎn)生；氣生菌絲多為灰白色和白色，在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上呈黃色；基內(nèi)菌絲灰色、褐色、灰褐色或橙黃色，同時該菌株在不同培養(yǎng)基上生長速度存在差異(表1)。

2.1.2生理生化特征 參照鏈霉菌鑒定手冊中放線菌分類所記載的生理生化試驗進行測定，結(jié)果表明，該菌株明膠液化反應呈陽性，且明膠液化速度快(圖2A)；牛奶凝固與胨化反應呈陽性(圖2B)；淀粉水解反應，菌落周圍遇碘不變色形成透明圈，但透明圈直徑小(圖2C)，表明該菌株可產(chǎn)生淀粉酶但活性不強；纖維素水解試驗結(jié)果為弱陽性，菌株在纖維素上有一些生長(圖2D)；該菌株在柴斯納(Tresner)瓊脂培養(yǎng)基上沒有黑色素產(chǎn)生，不產(chǎn)生H2S；該菌株能夠利用葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、木糖和甘露醇作為碳源，不能利用鼠李糖和肌醇。該結(jié)果與《鏈霉菌鑒定手冊》[15]和《伯杰細菌鑒定手冊》(第8版)[17]中有關(guān)微白黃鏈霉菌Streptomycesalbidoflavus所描述的生理生化特征基本相同，因此，初步認為菌株LYZ0255為S.albidoflavus。

圖1 放線菌LYZ0255菌株的菌落和形態(tài)特征Fig. 1 Morphological and cultural characteristics of actinomyces LYZ0255

培養(yǎng)基 Culturemedium 氣生菌絲 Aerialhypha 基內(nèi)菌絲 Substratehypha 可溶性色素 Solublepigment 生長狀況 Growthstate 高氏一號合成培養(yǎng)基Gause’ssyntheticagar灰白色Graywhite灰色Gray黃白色Yellowwhite慢Slowly克氏一號合成培養(yǎng)基Krassilnikov’ssyntheticagar白色White褐色Brown黃白色Yellowwhite慢Slowly察氏瓊脂培養(yǎng)基Czapek’sagar灰色Gray灰色Gray -快Quickly葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基Glucoseasparagineagar白色White褐色Brown微黃白色Yellowishwhite快Quickly葡萄糖酵母膏瓊脂Glucoseyeastextractagar灰色Gray灰褐色Taupe琥珀色Amber快Quickly淀粉瓊脂培養(yǎng)基Starchagar黃色Yellow灰色Gray琥珀色Amber快Quickly馬鈴薯塊培養(yǎng)基Potatodextroseagar灰色Gray橙黃色Orangeyellow微黃色Yellowish快Quickly

2.1.316S rDNA序列擴增和分析 對拮抗菌株16S rDNA序列進行PCR擴增，得到約1 400 bp的擴增片段(圖3)，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示LYZ0255的16S rDNA的全序列由1 388 bp個堿基構(gòu)成。在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果顯示，與其同源性高的菌株均為鏈霉菌屬(Streptomyces)，相似率在98.34～99.71%，其中S.albidoflavus(Z76676)與之相似率最高，為99.71%。基于與其同源性較高的菌株的16S rDNA的全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，該菌株與S.albidoflavus(Z76676)聚于同一個進化分支上(圖4)，與同源性比對結(jié)果一致，結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化鑒定結(jié)果將拮抗菌鑒定為微白黃鏈霉菌S.albidoflavus。

圖2 菌株LYZ0255生理生化特性Fig. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LYZ0255

圖3 菌株LYZ0255 PCR擴增結(jié)果Fig. 3 Polymerase chain reaction amplification results of the strain LYZ0255

M: Marker; L-1/L-2: LYZ0255擴增序列。

L-1/L-2: The amplification sequence of LYZ0255.

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的拮抗菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the antagonistic strain

2.2 放線菌LYZ0255對紅豆草殼二孢的抑菌作用

2.2.1對菌絲生長的的抑制效果 平板對峙試驗結(jié)果表明，該鏈霉菌菌株對紅豆草殼二孢表現(xiàn)出很強的拮抗作用，在對照長滿全皿，對照平板上紅豆草殼二孢直徑為63.1 mm時，對峙平板中紅豆草殼二孢直徑為16.2 mm(圖5),相對抑菌率達74.33%。

圖5 拮抗菌對紅豆草殼二孢菌絲的平板對峙試驗Fig. 5 Dural culture method of the antagonistic strain inhibit Ascochyta onobrychidis

拮抗菌株無菌發(fā)酵液對菌絲抑制結(jié)果顯示，待對照長滿全皿時，A-SFB平板病原菌菌落直徑與SFB處理、對照均呈極顯著差異(P<0.01)，其中A-SFB平板對菌絲生長的抑菌率達80.95%(圖6)，對紅豆草殼二孢病菌菌絲表現(xiàn)出很強的抑制作用；而SFB平板菌落生長狀況與無菌水處理一致，均對紅豆草殼二孢菌絲生長沒有抑制作用。

2.2.2對孢子萌發(fā)的抑制作用 用A-SFB處理紅豆草殼二孢病原菌孢子，其抑制病原孢子萌發(fā)效果顯著，抑制率達93.87%；而SFB處理和對照處理一致，紅豆草殼二孢病原孢子多數(shù)已經(jīng)萌發(fā)(圖7)，說明SFB對紅豆草病原菌孢子萌發(fā)沒有影響。

3 討論與結(jié)論

目前，對于紅豆草殼二孢引起的葉斑和黑莖病防治研究甚少，只通過室內(nèi)接種篩選出埃斯基為抗病品種[8]，和僅通過平板對峙發(fā)現(xiàn)沙打旺埃里磚隔孢對紅豆草殼二孢有一定的抑制作用[23]，因此尋找經(jīng)濟高效、能夠保證生態(tài)安全和具有開發(fā)潛力的生物防治手段是解決這一問題的有效途徑。本研究通過對分離得到的一株明顯抑制紅豆草殼二孢生長的放線菌菌株進行形態(tài)鑒定和16S rDNA序列分析，將其鑒定為微白黃鏈霉菌，該菌株在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列等方面參考模式菌株的相關(guān)信息[15,22]與微白黃鏈霉菌基本一致，只在碳源利用方面與模式菌株存在細微差異，模式菌株不能利用蔗糖，而該菌株可以利用，這可能是菌株之間存在變異的結(jié)果；同時拮抗菌株無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲和孢子萌發(fā)的抑制試驗結(jié)果均顯示，SFB處理和對照結(jié)果相同，排除了SFB對病原菌的影響，起抑制作用的即為該拮抗菌株。

圖6 拮抗菌對紅豆草殼二孢菌絲的抑菌效果和抑菌率Fig. 6 Inhibitory effect of antagonistic strain sterile fermentation broth to mycelium and the inhibitory rates

不同小寫字母表示經(jīng)Duncan新復極差法檢驗處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level by DMRT; different capital letters show significant differences at the 0.01 level by DMRT.

圖7 拮抗菌株無菌發(fā)酵液對紅豆草殼二孢孢子萌發(fā)的影響Fig. 7 Effect of the strain LYZ0255 sterile fermentation broth on spore germination of Ascochyta onobrychis

鏈霉菌在植物病害生物防治方面被廣泛應用于真菌引起的病害，并且利用鏈霉菌的代謝產(chǎn)物開發(fā)成微生物源農(nóng)藥防治植物病害是其在生物防治中最主要的應用形式，第一個實用化的農(nóng)用抗生素殺稻瘟菌素能顯著抑制水稻紋枯病菌。有研究表明,微白黃鏈霉菌具有抗菌活性，Chao等[24]發(fā)現(xiàn)微白黃鏈霉菌可以有效抑制葉霉病菌(Passalorafulva)，本研究通過該拮抗放線菌平板對峙試驗和無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長以及孢子萌發(fā)影響的測定，證明了微白黃鏈霉菌對紅豆草殼二孢有良好的抑制作用，說明其在紅豆草殼二孢葉斑和黑莖病生物防治和應用中潛力巨大，但是該菌株發(fā)酵液中哪些成分在起抑制作用、作用機理和溫室及大田防效等問題還需進一步探究。

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