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    新型人腺病毒55型在中國(guó)10年的持續(xù)流行及其基因進(jìn)化分析

    2018-05-26 04:16:39毛乃穎朱貞雷振強(qiáng)李巖黃芳尹潔陳萌向星宇李紅唐瀏英崔愛利李忠劉倜許文波
    關(guān)鍵詞:序列號(hào)進(jìn)化樹腺病毒

    毛乃穎 朱貞 雷振強(qiáng) 李巖 黃芳 尹潔 陳萌 向星宇 李紅 唐瀏英 崔愛利李忠 劉倜 許文波

    102206 北京,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(毛乃穎、朱貞、雷振強(qiáng)、李紅、唐瀏英、崔愛利、許文波);050021 石家莊, 河北省疾病預(yù)防控制中心(李巖);100013 北京市疾病預(yù)防控制中心(黃芳、陳萌);650022 昆明, 云南省疾病預(yù)防控制中心(尹潔);410005 長(zhǎng)沙, 湖南省疾病預(yù)防控制中心(向星宇);250014 濟(jì)南, 山東省疾病預(yù)防控制中心(李忠、劉倜)

    人腺病毒(human adenovirus, HAdV)為無(wú)包膜、二十面體對(duì)稱的雙鏈DNA病毒,基因組大小約36 kb,屬于人腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動(dòng)物腺病毒屬[1]。HAdV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括六鄰體(hexon)和五鄰體(penton),其中hexon是HAdV的主要抗原蛋白,既具有共同的群特異性抗原,也具有型特異性抗原,對(duì)免疫選擇壓力最為敏感;每個(gè)penton由一個(gè)基座(penton base)和纖維(fiber)組成,其中fiber具有血凝特性和型特異性抗原決定位點(diǎn)[2]。根據(jù)HAdV生物學(xué)特性和全基因組序列及其生物信息學(xué)分析等,至今已鑒定了83種HAdV型別(http://hadvwg.gmu.edu)。

    HAdV-55是中國(guó)首次鑒定的重要的呼吸道感染病原體,從2006年一起陜西省歧山縣中學(xué)暴發(fā)的呼吸道感染疫情中分離到,之前該病毒一直被誤認(rèn)為是HAdV-11a或HAdV-11-14型[3]。通過(guò)對(duì)HAdV-55病毒全基因組序列生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該病毒是在HAdV-14的基因組骨架上與HAdV-11進(jìn)行了部分Hexon基因的重組互換[4]。

    HAdV-55主要引起急性呼吸道感染,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喉嚨痛等上呼吸道癥狀,嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肺炎甚至死亡,尤其是在免疫缺陷患者中[5-6]。由HAdV-55引起的暴發(fā)流行時(shí)有報(bào)道,2004年在土耳其國(guó)際軍事訓(xùn)練營(yíng)發(fā)生數(shù)百人感染疫情,2005年在新加坡發(fā)生200多名入伍軍人感染疫情,2012年和2016年分別在中國(guó)河北、西藏、云南和四川省軍營(yíng)引起數(shù)百名士兵感染疫情[7-10]。同時(shí),近幾年不斷有HAdV-55引起的成人散發(fā)重癥肺炎疫情報(bào)道,因此HAdV-55已成為全世界范圍內(nèi)引起公共衛(wèi)生問(wèn)題的重要病原體之一[11-12]。

    本研究對(duì)2011—2014年從北京、河北、山東、云南和湖南5個(gè)省市的發(fā)熱呼吸道患者標(biāo)本中分離到的HAdV-55病毒株進(jìn)行了penton base、hexon和fiber三個(gè)基因的序列測(cè)定,并與從GenBank上下載的中國(guó)其他省市HAdV-55分離株序列和以及其他國(guó)家和地區(qū)HAdV-55基因序列進(jìn)行比較,并對(duì)HAdV-55在中國(guó)的流行和基因進(jìn)化特征進(jìn)行了初步分析。

    1 材料與方法

    1.1毒株信息2011—2014年,分別從北京、河北、山東、云南和湖南省等5個(gè)省市的發(fā)熱呼吸道癥候群患者標(biāo)本中用hep-2細(xì)胞系分離到HAdV-55病毒9株(表1)。

    表1 2011—2014年中國(guó)5省市分離到的HAdV-55毒株基本信息

    Tab.1 Information of HAdV-55 isolates from 5 Provinces during 2011-2014 in China

    1.2聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增腺病毒pentonbase、hexon和fiber目的基因和序列測(cè)定取200 μl病毒懸液采用商品化核酸提取試劑(QIAamp DNA Mini Kit,Qiagen,德國(guó))提取病毒,具體步驟詳見說(shuō)明書。5 μl病毒DNA提取液入到終體積50 μl的 PCR kit(金牌Mix green, 擎科,北京)反應(yīng)體系中,加入終濃度0.2 μmol/L的上下游引物擴(kuò)增目的基因penton base、hexon和fiber基因片段,引物詳見參考文獻(xiàn)[6]。PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果用Sequencher 5.0軟件進(jìn)行核苷酸序列拼接整理。

    1.3序列比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)建立序列測(cè)定及基因進(jìn)化分析從GenBank上下載19株中國(guó)HAdV-55病毒hexon全長(zhǎng)基因序列,分別來(lái)自2006—2016年間云南、廣東、山西、江蘇、陜西、河北、重慶、四川、西藏、遼寧、天津11個(gè)省市、自治區(qū)和直轄市;以及其他12株基因序列,分別來(lái)自美國(guó)、西班牙、韓國(guó)和中國(guó),時(shí)間從1969年至2016年,再加入本研究的9株分離株序列,共計(jì)獲得40株HAdV-55病毒的hexon基因全長(zhǎng)序列,建立hexon基因數(shù)據(jù)庫(kù)。從GenBank下載全球不同時(shí)期流行的HAdV-55病毒流行株fiber基因全長(zhǎng)序列59株,再加入本研究的9株分離株序列,共計(jì)獲得68株HAdV-55病毒的fiber基因全長(zhǎng)序列,分別來(lái)自中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、西班牙,建立fiber基因數(shù)據(jù)庫(kù)。從GenBank下載全球不同時(shí)期流行的HAdV-55病毒流行株penton base基因全長(zhǎng)序列25株,再加入本研究的9株分離株序列,共計(jì)獲得34株HAdV-55病毒的penton base基因全長(zhǎng)序列,建立penton base基因數(shù)據(jù)庫(kù)。用MEGA7.0軟件[13]對(duì)HAdV-55毒株的hexon、fiber和penton base序列進(jìn)行比對(duì),同時(shí)加入HAdV-3(GenBank序列號(hào):DQ099432)、HAdV-7(GenBank序列號(hào):JX423383)、HAdV-11p(GenBank序列號(hào):AY163756)、HAdV-14(GenBank序列號(hào):AY803294)、HAdV-16(GenBank序列號(hào):JN860680)、HAdV-34(GenBank序列號(hào):AY737797)、HAdV-35(GenBank序列號(hào):AC_000019)、HAdV-50(GenBank序列號(hào):AY737798)原型株序列作為外部組建立核苷酸的序列比對(duì)文件。

    1.4系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和進(jìn)化分析用MEGA7.0軟件中鄰接法(Neighbor-jioning method,NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood method, ML)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)化樹可靠性估計(jì)Bootstrap值設(shè)定為1 000。使用BEAST1.8.4軟件構(gòu)建HAdV-55的hexon和fiber基因全長(zhǎng)的進(jìn)化樹和推測(cè)病毒的核苷酸進(jìn)化速率,計(jì)算方法基于用貝葉斯馬爾科夫鏈蒙特卡洛(MCMC)分析,貝葉斯分析中使用SRD06作為核苷酸替換模式。

    2 結(jié)果

    2.1hexon、pentonbase和fiber基因同源性分析本研究獲得的9株HAdV-55病毒株的hexon基因全長(zhǎng)的同源性分別為99.9%~100%,與HAdV-55原型株(QS-DLL株分離于2006年,GenBank序列號(hào):FJ643676)的核苷酸序列同源性為99.9%~100%,與最古老西班牙株(273株,于1969年分離,GenBank序列號(hào):FJ841900)的同源性為99.8%,與HAdV-B11p的同源性為98.2%~98.3%。北京Beijing2011-031株在Hexon基因第1 629位核苷酸有T→C的無(wú)義突變。云南2株病毒在Hexon基因第1 694位核苷酸共享A→G替代,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從N→S轉(zhuǎn)換,在第2 539位核苷酸共享A→T替代,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從T→S轉(zhuǎn)換。本研究9株分離株的fiber基因同源性分別為99.9%~100%,與HAdV-55原型株(QS-DLL株)的同源性為99.9%~100%,與最古老西班牙273株的同源性為99.8%~99.9%,與HAdV-B14的同源性為99.4%~99.5%;云南2株病毒在585位置共享G→A無(wú)義突變,河北Hebei2012-3和Hebei2012-0045毒株在619位置共享A→C替代,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從T→P轉(zhuǎn)換,北京Beijing2012-115和山東Shandong2013-7 577株在955位置核苷酸共享T→C替代,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從Y→H轉(zhuǎn)換。9株病毒的penton base基因序列極為保守,僅僅在云南Yunnan2014-9705和Yunnan2014-9 754株中發(fā)現(xiàn)在1 506位置核苷酸共享C→T的無(wú)義突變,而與其他毒株包括HAdV-55原型株(QS-DLL株)核苷酸序列均為100%一致,所有毒株與HAdV-B14的核苷酸序列同源性為高達(dá)99.8%。

    圖1 腺病毒55型分離株與其代表株的hexon、fiber和penton base基因全長(zhǎng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the HAdV-55 based on hexon, fiber and penton base gene

    2.2進(jìn)化樹的構(gòu)建基于HAdV-55病毒分離株hexon(2 841 bp)、fiber(978 bp)和penton base(1 674 bp)全長(zhǎng)基因,分別利用NJ 法和ML 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致,本文僅顯示ML法構(gòu)建結(jié)果(圖1)。Hexon基因進(jìn)化樹顯示,HAdV-55和HAdV-11p的聚集在一個(gè)分支中,而fiber和penton base基因進(jìn)化樹均顯示HAdV-55病毒株和HAdV-14原型株聚集在同一個(gè)分支中,說(shuō)明其共同的重組進(jìn)化來(lái)源。1969年分離到的西班牙HAdV-55病毒株位于一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支,說(shuō)明其與其他年代的毒株遺傳距離較大。本研究獲得的9株HAdV-55和從GenBank下載的國(guó)內(nèi)外HAdV-55毒株在hexon基因進(jìn)化樹上均位于同一分支,說(shuō)明HAdV-55的Hexon基因高度保守。同樣,本研究的9株病毒和其他時(shí)間和地點(diǎn)流行株的Fiber和penton基因在進(jìn)化上是高度保守的,均位于一個(gè)進(jìn)化分支。然而hexon基因的MCMC進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖2),HAdV-55的hexon基因在進(jìn)化樹具有明顯的時(shí)間聚集性,1969年的西班牙273株形成一個(gè)獨(dú)立分支, 1997年的美國(guó)株和2005年新加坡株形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支,2001年和2002年分離到的臺(tái)灣株形成一個(gè)獨(dú)立分支,而2006年我國(guó)陜西省岐山縣分離到的HAdV-55原型株(QS-DLL株)形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支,而其他2010年以后流行的HAdV-55株與之形成一個(gè)共同進(jìn)化分支。

    圖2 腺病毒55型分離株與其代表株的hexon基因貝葉斯進(jìn)化樹Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of the HAdV-55 based on hexon gene were conducted in beast 1.8.4. Coloured branches represent different collection years of HAdV-55 viruses.)

    2.3進(jìn)化率和最新的共同祖先(tMRCA)分析基于hexon基因貝葉斯分析發(fā)現(xiàn),非相關(guān)對(duì)數(shù)正態(tài)松弛(Uncorrelated lognormal relaxed clock model)分子鐘模型最適合作為HAdV-55的hexon基因進(jìn)化率計(jì)算的模型參數(shù)。根據(jù)選定的模型計(jì)算結(jié)果顯示,HAdV-55毒株Hexon基因的估計(jì)核苷酸替換率約為5.228×10-5substitutions/site/year(95%可信區(qū)間為0.05~1.09×10-4),fiber基因的估計(jì)核苷酸替換率約為1.238×10-4substitutions/site/year(95%可信區(qū)間為0.32~2.33×10-4)。HAdV-55株hexon基因起源的tMRCA可追溯到1963年(95%可信區(qū)間為1915.5~2062.0)。

    3 討論

    自2006年HAdV-55首次被鑒定以來(lái),由其導(dǎo)致的急性呼吸道感染公共衛(wèi)生事件在中國(guó)及全世界范圍內(nèi)時(shí)有報(bào)道,尤其常見于兵營(yíng)。同時(shí),HAdV-55還可引發(fā)成人重癥肺炎。本研究對(duì)5個(gè)省市發(fā)熱呼吸道癥候群患者標(biāo)本中分離到HAdV-55毒株進(jìn)行了hexon、fiber和penton base三個(gè)基因的序列測(cè)定,同時(shí)與2006—2016年在12個(gè)省(市、自治區(qū)和直轄市)流行的HAdV-55病毒株進(jìn)行了比對(duì),并利用多種序列分析軟件進(jìn)行了同源性和基因進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,HAdV-55自2006年首次發(fā)現(xiàn)至今的10年間在我國(guó)形成了廣泛傳播和持續(xù)流行態(tài)勢(shì),并且已成為我國(guó)重要的呼吸道感染以及肺炎病原體之一。

    基因重組是HAdV進(jìn)化和免疫逃逸的一個(gè)重要特征,HAdV-55就是由HAdV-11和HAdV-14通過(guò)同源重組形成[1,14]?;仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn),以前劃分為HAdV-11a的病毒分離株實(shí)際上就是HAdV-55病毒株,因此,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最早的HAdV-55可以追溯到1969年的西班牙273株。基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),HAdV-55病毒株的hexon、fiber和penton base三個(gè)基因均高度保守,所有毒株三個(gè)基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均>99%,在penton base和fiber基因ML進(jìn)化樹上,HAdV-55和HAdV-14位于同一個(gè)進(jìn)化分支,而hexon基因的ML進(jìn)化樹顯示,HAdV-55和HAdV-11位于同一個(gè)進(jìn)化分支。然而,與HAdV-55原型株(QS-DLL)比較,2011年北京和2014年云南分離的毒株hexon基因均有獨(dú)特的核苷酸替代,但由于基因同源性較高,在ML進(jìn)化樹中分支并不明顯,進(jìn)一步構(gòu)建MCMC進(jìn)化樹,結(jié)果中較為清晰的顯示了基于hexon基因的進(jìn)化時(shí)間聚集特征,不同時(shí)間來(lái)源的分離株聚集在不同的進(jìn)化分支中,提示HAdV-55在進(jìn)化上有一定的時(shí)間聚集進(jìn)化趨勢(shì)。

    本研究發(fā)現(xiàn), HAdV-55病毒 hexon和fiber基因的核苷酸進(jìn)化率分別為5.228×10-5和1.238×10-4substitutions/site/year,要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他B屬HAdV,如HAdV-3和HAdV-7病毒 Hexon和fiber基因的核苷酸進(jìn)化率(分別為0.234×10-3和1.085×10-3、0.132×10-3和1.107×10-3、substitutions/site/year)[15],結(jié)果提示HAdV-55可能在進(jìn)化上更加保守穩(wěn)定。但考慮到本研究涉及的hexon基因毒株多數(shù)來(lái)自近10年,且70%以上的毒株來(lái)自中國(guó),其他毒株僅僅來(lái)自韓國(guó)、美國(guó)和西班牙3個(gè)國(guó)家,因此有可能會(huì)低估了HAdV-55的進(jìn)化速率。目前,隨著腺病毒全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟,來(lái)自世界不同國(guó)家地區(qū)和不同年代HAdV-55基因數(shù)據(jù)的不斷積累,將會(huì)更加準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)HAdV-55進(jìn)化速率和時(shí)間地理進(jìn)化趨勢(shì),為HAdV-55疫苗的相關(guān)研究和預(yù)防控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

    綜上所述,本研究通過(guò)基于hexon、fiber和penton base基因的生物信息學(xué)分析,對(duì)過(guò)去10年間我國(guó)HAdV-55病毒株進(jìn)行了流行和基因進(jìn)化特征分析,報(bào)道了HAdV-55的進(jìn)化趨勢(shì)和進(jìn)化速率;盡管本研究結(jié)果顯示HAdV-55的三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白在進(jìn)化上極為穩(wěn)定,但仍然在選擇壓力下緩慢進(jìn)化,具有一定的時(shí)間進(jìn)化趨勢(shì)。為了更好應(yīng)對(duì)由HAdV-55導(dǎo)致的呼吸道感染暴發(fā)或者散發(fā)公共衛(wèi)生事件,必須建立連續(xù)有效的監(jiān)測(cè)體系,掌握其在我國(guó)的進(jìn)化及流行動(dòng)態(tài)。同時(shí),考慮到HAdV-55暴發(fā)流行感染人群的特殊性,對(duì)研制HAdV-55疫情應(yīng)急疫苗相關(guān)研究也應(yīng)獲得重視。

    利益沖突無(wú)

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