1株野生鼠諾如病毒的全基因組序列測定及分析

劉蒙蒙 李利利 林琳 王笑峰 段招軍

266021 山東，青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系(劉蒙蒙、王笑峰);100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室(李利利、段招軍);250014 濟(jì)南，山東省疾病預(yù)防控制中心 山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院 山東省傳染病預(yù)防控制重點實驗室(林琳)

諾如病毒(noroviruses，NVs)又稱諾瓦克病毒，屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是全世界引發(fā)非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)和散發(fā)的重要病原[1-2]。諾如病毒屬成員分為5個基因群，其中感染人的主要為GⅠ、GⅡ和GIV，感染牛的為GⅢ，感染馬和豬的主要為GⅡ，而GV主要感染小鼠[3- 4]。2003年Karst從實驗室小鼠中首次發(fā)現(xiàn)并分離了鼠諾如病毒-1(murine Norovirus-1,MNV-1)[5]。除了實驗室小鼠，通過血清學(xué)或分子檢測也在野生嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)了MNV[6-7]。

鼠諾如病毒(MNV)為單股正連RNA病毒，具有杯狀病毒的典型特征，基因組全長7.3 kb左右，RNA的3’末端為poly(A)結(jié)構(gòu)，5’末端無帽結(jié)構(gòu)，而與一個小分子量的蛋白(VPg)共價相連[6]。諾如病毒基因組主要包括3個開放閱讀框(open reading frame, ORFs)：RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)包含在此區(qū)域；ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1，包括內(nèi)部的核心區(qū)S區(qū)和向外突出的P區(qū)，P區(qū)分為P1和P2，P2區(qū)位于衣殼蛋白的最外層較易發(fā)生突變；ORF3編碼小結(jié)構(gòu)蛋白VP2，該蛋白可增強(qiáng)衣殼蛋白的表達(dá)和病毒的穩(wěn)定性[8]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)所有MNV都有第四個ORF(ORF4)，與ORF2重疊，編碼的蛋白參與固有免疫應(yīng)答[9]因為MNV能在細(xì)胞和動物中復(fù)制，使得小鼠成為研究諾如病毒生物學(xué)和致病機(jī)理的模式動物，這有助于研究人員進(jìn)一步探索人諾如病毒預(yù)防和治療感染的途徑。本研究通過對來自山東省不同區(qū)域的野生鼠MNV開展相關(guān)研究，為更全面的了解國內(nèi)MNV病毒的分子遺傳特征提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本2016年11月份在山東省濟(jì)寧市嘉祥縣、青島市黃島區(qū)、淄博市淄川區(qū)捕鼠210只，鼠種包括褐家鼠、黑線姬鼠、大倉鼠、小家鼠、黃胸鼠和鼩鼱。解剖取其腸內(nèi)容物和肝臟樣本，運(yùn)輸至中國疾病預(yù)防控制中心，置于液氮中保存。本研究實驗方案通過動物實驗倫理審查，編號為20160715023。

1.2酶與試劑

1.2.1 核酸提取: QIAamp MinElute Virus Spin Kit，購自德國Qiagen公司，核酸置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核酸酶消化：DNaseI 消化酶，購自美國Thermo Scientific 公司。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄: SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA酶抑制劑(RRI)、dNTP購自日本TakaRa公司。

1.2.4 全基因組擴(kuò)增: RT-PCR試劑盒，LA-Taq酶，Premix Ex Taq試劑， rapid amplification of cDNA Ends (RACE)試劑盒，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自日本TakaRa公司，T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，PGEM T-easy載體購自美國Promega公司。

1.3標(biāo)本的處理及病毒核酸提取在二級生物安全柜中取綠豆大小的老鼠肝臟和糞便標(biāo)本分別加入1 ml minimum essential medium (MEM)進(jìn)行勻漿，勻漿頻率60 Hz，時間60 s。勻漿后的混合液用4 ℃離心機(jī)6 868×g離心20 min，取上清備用。將20～30只鼠的肝組織和糞便標(biāo)本勻漿液分別混合，肝組織標(biāo)本和糞便標(biāo)本各建立10個混合樣本庫。分別從每個混合樣本庫中取200 μl勻漿液經(jīng)DNaseI處理后進(jìn)行RNA的提取，洗脫液為50 μl，提取的核酸送到華大基因進(jìn)行高通量測序。

1.4病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄將提取的核酸用SuperScript Ⅲ試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，反應(yīng)體系為20 μl，條件如下: 隨機(jī)引物1 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，病毒核酸10 μl，65 ℃ 5 min 預(yù)處理；5×Buffer 4 μl，0.1 mmol/L DTT 2 μl，RRI 0.5 μl，SSⅢ 0.5 μl, DNA free H2O 1 μl，25℃10 min，42 ℃ 50 min，72℃15 min，cDNA置于-20 ℃儲存。

1.5病毒基因組擴(kuò)增根據(jù)高通量測序拼接獲得的MNV序列設(shè)計引物，引物設(shè)計使用軟件Primer 5.0(加拿大Premier公司)，采用SeqMan軟件拼接序列。用PCR方法填補(bǔ)已知序列之間的未知序列。5′和3’末端序列采用rapid amplification of cDNA ends(RACE)方法進(jìn)行擴(kuò)增，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，對于RACE擴(kuò)增獲得的條帶進(jìn)行切膠回收，克隆測序獲得目的序列，經(jīng)拼接后獲得該株MNV的全基因組序列。PCR產(chǎn)物序列測定在北京天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行。

1.6小鼠諾如病毒陽性標(biāo)本的篩查根據(jù)獲得的全基因組序列設(shè)計引物擴(kuò)增， VP1區(qū)(F1 5’-GGGTTGGCACCGTCTCATT-3’, F2 5’-TAACCTTGAGCTTGGCCC-3’, R 5’-TAGTCGGGCAACTCATCC-3’)和RdRp區(qū)(F1 5’-AGATTGGACTGGGACGTGCTT-3’， R1 5’-GCCCATACCAACCGAACTGAT-3’，F(xiàn)2 5’-ATACTGATGCTGACTTCTCCCG-3’，R2 5’-AGAGACAACCTCGTCATCACCA-3’)，擴(kuò)增長度分別為120 bp和307 bp。210份標(biāo)本進(jìn)行篩查。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：Premix Ex Taq 12.5 μl，DNA free H2O 9.5 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，(引物一輪RdRP F1/R1,VP1 F1/R；二輪RdRP F2/R2,VP2 F2/R)，反應(yīng)條件為94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)，對獲得的目的條帶進(jìn)行測序。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對，同時利用MEGA5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值為1,000。

2 結(jié)果

2.1MNV基因組結(jié)構(gòu)特征本研究獲得的MNV變異株基因組全長為7 382 bp(命名為SDHD46)。3′端包含75 bp非編碼區(qū)和pol(A) 結(jié)構(gòu)，5’端無帽結(jié)構(gòu)而與小分子量的蛋白(VPg)共價相連。編碼區(qū)包括四個開放閱讀框(ORFs)，ORF1長5 061 bp (6～5 066 nt)，編碼1 686個氨基酸，與大多數(shù)MNVs相比少3個核苷酸；ORF2長1 629 bp(5 053～6 681 nt)編碼衣殼蛋白VP1(542個氨基酸)，比已知的大部分MNVs的ORF2區(qū)(1 626 bp)多三個核苷酸序列，相應(yīng)的多編碼一個氨基酸。其中ORF1 和ORF2之間有14個核苷酸的重疊區(qū)。ORF3長627 bp (6 681～7 307 nt)，編碼小結(jié)構(gòu)蛋白VP2(208個氨基酸)；ORF4 (5 066～5 707)包含在ORF2中，編碼213個氨基酸。 MNV SDHD46的基因組序列上傳至GenBank，序列號為MF973199。

2.2MNV在野生鼠中的檢出分別用VP1區(qū)的半巢式及和RdRp區(qū)的巢式引物對210份鼠腸道標(biāo)本中的MNV進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示2份標(biāo)本為MNV陽性，陽性率為0.95%。2份標(biāo)本均來自青島市黃島區(qū)的黑線姬鼠。山東濟(jì)寧市和淄博市采集的嚙齒動物標(biāo)本中并未檢測到該病毒，說明MNV感染可能與野鼠的地理分布有關(guān)。

2.3MNV同源性分析本次實驗分離出的MNV與選取的30株MNV參考株的全基因組核苷酸序列相似度為76.8%～78.1%，其中衣殼蛋白區(qū)VP1核苷酸序列相似度為77.1%～88.5%，編碼的氨基酸相似度為82.0%～90.6%，RdRp區(qū)編碼的氨基酸相似度為89.8%～94.7%。但是VP1高可變區(qū)域P2(278～415aa)區(qū)氨基酸序列相似度較低，為60.9%～78.1%，表明諾如病毒易于變異的特點。獲得的MNV與參考株的相似度分析參見表1。

表1 MNV SDHD46與來自不同地域的30株參考株序列的相似度分析

Tab.1Identity of the nucleotide and amino acid sequences between MNV SDHD46 and 30 reference strains.

2.4SDHD46VP1區(qū)氨基酸變異分析進(jìn)行了氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)與30株參考毒株序列比較，SDHD46VP1區(qū)多了一個氨基酸，其中 SDHD46 與匈牙利的兩株(JQ408737和JQ408738)比較，363位多一個甘氨酸 (Glycine, G)；與其他的28株MNVs VP1序列比較301位多一個脯氨酸(Proline, P)。進(jìn)一步分析SDHD46 VP1不同功能區(qū)氨基酸位點突變情況，發(fā)現(xiàn)S區(qū)只出現(xiàn)一個突變位點，P2區(qū)出現(xiàn)11個突變位點， P1區(qū)有4個突變位點。氨基酸突變位點見表2。

2.5MNV系統(tǒng)進(jìn)化分析為了明確MNV衣殼蛋白VP1的系統(tǒng)進(jìn)化特征，我們構(gòu)建了基于核苷酸序列的進(jìn)化樹，如圖1所示，SDHD46與來自匈牙利的毒株TF7WM(JQ408738)親緣關(guān)系最近，并與來自匈牙利的毒株TF7WM 和TF5WM(JQ408737和JQ408738)以及來自英國的毒株Apo496和Apo455(JN975483和JN975491)聚集在一起形成另一進(jìn)化分支。雖然本研究MNV毒株分離自中國，但其在進(jìn)化分枝上與來自中國北京和廣州(KM458057和 KX987840)的兩株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。基于RdRp氨基酸序列的進(jìn)化樹分析表明(見圖2)，SDHD46與來自英國的毒株Apo455親緣關(guān)系最近，并聚集在一起形成獨(dú)立進(jìn)化支。在VP1進(jìn)化分析中與本研究MNV親緣關(guān)系較近的匈牙利毒株TF7WM 和TF5WM和另一英國毒株Apo496無對應(yīng)的RdRp基因序列，無法明確其在RdRp區(qū)的進(jìn)化關(guān)系是否與VP1一致。

表2 SDHD46與30株參考株VP1區(qū)氨基酸序列的突變位點

Tab.2The mutation of amino acid sequences in VP1 region of SDHD46 and 30 reference strains

注：30株參考毒株GenBank號; Notes. Gene Bank numbers of the 30 reference strains(JQ408738、JQ408737、JN975491、JN975483、JN975535、JN975533、EU004673、EU004670、DQ223043、DQ223041、DQ223042、GQ180108、EF650480、EF650481、EU004663、EU004672、AY228235、AB601769、AB435515、AB435514、HQ317203、KX987840、KM458057、DQ911368、EF531291、EU854589、EU482058、EU482057、FJ446720、FJ446719)

注：紅色圓圈代表本實驗在野生鼠中的分離株
圖1鼠諾如病毒VP1區(qū)核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹
Note:The red circle represents the isolates of SDHD46
Fig.1 Phylogenetic analysis based on the sequences of VP1 gene of MNV

注：紅色圓圈代表本實驗在野生鼠中的分離株
圖2鼠諾如病毒RdRP區(qū)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹
Note:The red circle represents the isolates of SDHD46
Fig.2 Phylogenetic analysis based on the amino acid of RdRP gene of MNVs

3 討論

自MNV首次被報道以來，國際上已經(jīng)分離獲得多株病毒。MNV是目前已知的小鼠病毒中流行率最高，感染率高，流行范圍廣的動物病毒[10]。2005年，美國和加拿大的實驗室用血清學(xué)方法檢測實驗室MNV的感染率約為22.1%，其感染率約為細(xì)小病毒(感染率為2.5%)的9倍[11]。2011年袁文等[12]報道我國廣東省實驗小鼠攜帶有MNV，用RT-PCR的方法檢測到206份小鼠盲腸內(nèi)容物，其中MNV陽性為77份，陽性率為37.38%，而且各品系小鼠易感性無顯著差異。 MNV在日本的感染率為13.1%[13]，在韓國的感染率為15.03%[14]。

本研究分離出的SDHD46是國內(nèi)分離出的首株野生鼠諾如病毒，SDHD46與已經(jīng)報道的野生鼠和實驗室MNVs的全基因組同源性差異明顯(>21.9% nt)，其中與野生鼠VP1區(qū)同源性差異為(>12.5% nt, >9.4% aa)，這表明野生鼠MNV比實驗鼠MNV之間存在較高的遺傳變異率。同時結(jié)合我們分析的SDHD46 P2區(qū)的變異位點也說明了野生鼠具有較高的遺傳變異性。 Smith報道了MNV在黑線姬鼠中具有較高的感染率和遺傳變異率，并且說明了MNV具有久遠(yuǎn)的感染起源，其感染與種屬特異性相關(guān)，本研究在收集的6種(褐家鼠、黑線姬鼠、大倉鼠、小家鼠、黃胸鼠和鼩鼱)不同種類的小鼠中，只在黑線姬鼠中檢測出兩個陽性標(biāo)本，這與Smith等[6]報道一致。與人類諾如病毒相似，MNV的P2區(qū)極易變異且含有特異性抗原決定簇和受體結(jié)合位點。有報道稱，VP1區(qū)氨基酸的突變可能影響其與受體結(jié)合的特異性和親和力，導(dǎo)致MNV毒力的改變[15]。此外，有研究表明，P2亞結(jié)構(gòu)域在病毒產(chǎn)生致死作用中發(fā)揮重要作用[16]。如圖2所示，SDHD46的氨基酸變異位點主要集中在P2區(qū)(278～415aa)，而且突變頻率高，變異率大，可能影響MNV的相關(guān)生物學(xué)功能，由基因突變導(dǎo)致的功能變化尚需進(jìn)一步研究。

人NoVs存在多種傳播途徑，重組變異率高，而且缺乏持續(xù)的免疫力，因此NoVs感染極易形成暴發(fā)性腸胃炎，產(chǎn)生嚴(yán)重的公共安全問題。但是由于人NoVs缺少合適的小動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所以MNV的發(fā)現(xiàn)為其研究提供了依據(jù)。MNV能夠在體外進(jìn)行生長增值，在骨髓來源的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上生長并產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，也可以在傳達(dá)細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7上生長并產(chǎn)生細(xì)胞病變[13]。MNV的可復(fù)制特點使其成為研究NoVs 復(fù)制機(jī)制、感染機(jī)理、免疫機(jī)制和抗感染等方面最理想的病毒模型，研究人員從MNV著手研究NoVs病毒結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制機(jī)制等方面都取得了重大進(jìn)展。本研究中分離出的野生鼠MNV變異株與已知的MNVs具有一定程度的差異，豐富了國內(nèi)MNV的基因庫，通過對該株MNV的基因結(jié)構(gòu)、變異特點和進(jìn)化來源進(jìn)行比較分析，為了解國內(nèi)MNV病毒的分子遺傳特征，流行特點和進(jìn)化來源研究提供了參考依據(jù)。

利益沖突:無

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