兒童腸球菌耐萬(wàn)古霉素表型和耐藥基因檢測(cè)分型的研究*

張彩虹 張學(xué)忠

(淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255036)

腸球菌已成為導(dǎo)致醫(yī)院感染的重要病原菌，隨著抗菌藥物選擇壓力的不斷提高，目前腸球菌獲得耐藥性明顯增強(qiáng)，且呈多重耐藥，耐萬(wàn)古霉素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE)所致的醫(yī)院感染呈逐年上升趨勢(shì)[1-3]。近些年兒童腸球菌導(dǎo)致敗血癥的發(fā)病率增加了6倍[2]。目前兒童感染VRE的臨床治療相當(dāng)棘手，可用于治療VRE感染的抗菌藥物非常有限，包括價(jià)格昂貴的利奈唑胺、達(dá)托霉素及毒副作用較大的氯霉素[4-5]。本研究共采集患兒170個(gè)肛門拭子進(jìn)行腸球菌培養(yǎng)及鑒定，篩選出VRE菌株并進(jìn)行表型及基因型檢測(cè)，對(duì)VRE定植菌菌種構(gòu)成、耐藥基因型及表型進(jìn)行檢測(cè)分析，探討是否存在新的耐藥基因簇，為兒童VRE醫(yī)院感染防控提供初步實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床實(shí)驗(yàn)菌株 2016年1月～12月期間，每月1次于我院兒科采集10～20位住院患兒肛門拭子，分離經(jīng)耐萬(wàn)古霉素腸球菌篩選鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性，革蘭染色符合腸球菌形態(tài)的細(xì)菌。質(zhì)控菌株：由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供， 糞腸球菌ATCC29212。儀器設(shè)備采用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，PCR儀 Deltier Thermal Gradient Cycler PTC-200抗菌藥物粉劑為慶大霉素、氨芐西林、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、利奈唑胺由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，萬(wàn)古霉素、青霉素、替考拉寧購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)定萬(wàn)古霉素、替考拉寧、青霉素、慶大霉素、氨芐西林、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、利奈唑胺對(duì)21株耐萬(wàn)古霉素腸球菌的最低抑菌濃度。MIC值為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物稀釋度?？咕幬锝Y(jié)果解釋和判讀均按2015版美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[6]，根據(jù)所測(cè)得的MIC值判讀細(xì)菌藥敏結(jié)果為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)，見(jiàn)表1。

1.2.2 PCR引物 vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、E. faecalis、E. faecium、rrs (16S rRNA)引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[7]，由廣州華大基因生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表2。

表1 抗菌藥物對(duì)腸球菌的MIC結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for judging MIC results of enterococci by antibiotics

表2 用于擴(kuò)增van基因的引物Table 2 Primers for amplification of van gene

1.2.3 PCR法確認(rèn)菌種 反應(yīng)體系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl雙蒸水，1.0μl引物1-F，1.0μl引物1-R，1.0μlDNA模板。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像和測(cè)序。

1.2.4 PCR法檢測(cè)耐藥基因型 反應(yīng)體系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl雙蒸水，1.0μl引物2-F，1.0μl引物2-R，1.0μlDNA模板。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像和測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 本研究中納入170例兒童肛門拭子中篩選出21株VRE，其陽(yáng)性率12.4%。在分離的21株VRE中屎腸球菌最常見(jiàn)為14株(66.7%)，糞腸球菌為4株，鶉雞腸球菌1株，鉛黃腸球菌1株和不明菌株1株。

2.2 分離的21株VRE對(duì)8種抗生素MIC的測(cè)定 本研究中VRE對(duì)大部分納入測(cè)定的抗菌藥物的耐藥率超過(guò)50%，包括對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為90.5%，對(duì)青霉素者為81%，對(duì)氨芐西林者為76.2%，對(duì)慶大霉素高度耐藥(High level aminoglycosides resistance, HLAR)為61.9%。而對(duì)米諾環(huán)素敏感率為95.2%，對(duì)利奈唑胺的敏感率為100%，見(jiàn)表3。

表3 8種抗菌藥物對(duì)21株VRE的MIC值(mg/L)Table 3 MIC value of 8 antibiotics against 21 strains of VRE

2.3 分離的21株VRE對(duì)糖肽類抗菌藥物耐藥情況測(cè)定 本研究分離的21株VRE均對(duì)糖肽類抗菌藥物耐藥，見(jiàn)表4、表5。

表4 萬(wàn)古霉素對(duì)21株耐VRE的MIC值(mg/L)分布Table 4 MIC value distribution of vancomycin against 21 VRE resistant strains

表5 替考拉寧對(duì)21株耐VRE的MIC值(mg/L)Table 5 Teicoplanin against 21 strains of VRE resistant MIC value

2.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)及測(cè)序

2.4.1 經(jīng)PCR檢測(cè)21株耐萬(wàn)古霉素腸球菌耐藥基因型，18株含vanA型耐藥基因，1株含vanC1型耐藥基因，1株vanC2/3型耐藥基因，1株耐藥基因不明確。vanA基因型是本研究中VRE最常見(jiàn)的耐藥基因型。以陰性對(duì)照，行PCR，分別選取1株vanA， vanC1、vanC2基因產(chǎn)物電泳成像，見(jiàn)圖1。

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳耐萬(wàn)古霉素腸球菌PCR產(chǎn)物結(jié)果

Figure12%agarosegelelectrophoresisresultsofvancomycinresistantEnterococcusPCRproducts

注：M.molecular size marker(1kb ladder) Lanes； 1.陰性對(duì)照; 2.vanA基因陽(yáng)性對(duì)照; 3.vanA基因; 4. vanC1基因;5.vanC2/C3基因; 6.屎腸球菌；7.糞腸球菌

2.4.2 將PCR擴(kuò)增獲得的耐藥基因片段進(jìn)行測(cè)序(含vanA、vanC1 、vanC2/C3基因菌株各1株), 所得結(jié)果與GenBank 上已知序列進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)vanA、vanC1 、vanC2/C3基因均未發(fā)生突變，見(jiàn)圖2。

2.5 追蹤VRE定植陽(yáng)性者 追蹤分析VRE定植陽(yáng)性患者，根據(jù)臨床醫(yī)生診斷及有感染癥狀患者的痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)、尿培養(yǎng)等檢查，21例VRE定植患者沒(méi)有繼發(fā)VRE感染。

3 討論

研究已證實(shí)VRE對(duì)大部分抗菌藥物耐藥[3,5]。VanA與VanB是耐萬(wàn)古霉素腸球菌6個(gè)表型中最常見(jiàn)的表型[8-10]。VanA 表型呈萬(wàn)古霉素和替考拉寧均高水平耐藥，VanB 表型呈萬(wàn)古霉素高水平耐藥, 替考拉寧低水平耐藥，VanC 表型呈萬(wàn)古霉素和替考拉寧均低水平耐藥，天然耐藥[11]。VRE基因型與表型可不一致，據(jù)報(bào)道，有VanB表型-vanA基因型,VanD 表型-vanA基因型，VanB表型-vanC1+vanB基因型等[12-14]。VRE常常顯示多重耐藥(如屎腸球菌通常耐氨基糖苷類和青霉素類)，鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素呈低水平耐藥。屎腸球菌大多對(duì)萬(wàn)古霉素呈高度耐藥，而糞腸球菌較少見(jiàn)。

圖2耐藥基因測(cè)序
Figure2Resistancegenesequencing

注：a. vanA(89)-FOR；b. vanA(89)-REW；c. vanC1(116)-FOR；d. vanC1(116)-EWR；e. VanC2/3(53)-FOR；f. VanC2/C3(53)-REW

文獻(xiàn)報(bào)道[15]，韓國(guó)醫(yī)院15%VRE為VanD表型-vanA基因型，即含vanA基因，卻對(duì)替考拉寧敏感或中介。通過(guò)體內(nèi)外一系列實(shí)驗(yàn)證明，替考拉寧治療VanD-vanA的VRE菌株感染將會(huì)失敗。研究提示，盡管VanD-vanA的VRE菌株對(duì)替考拉寧敏感，但體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明替考拉寧對(duì)治療VanD-vanA 型VRE菌株感染無(wú)效。通過(guò)體外藥敏檢測(cè)VRE菌的表型，不能作為臨床治療中選擇抗菌藥物唯一的依據(jù)，因此在治療耐萬(wàn)古霉素腸球菌時(shí)耐藥基因型測(cè)定更有參考價(jià)值。

糞便、肛門拭子是篩查分離VRE的最常用標(biāo)本[16]。本研究所取170個(gè)肛門拭子中，耐萬(wàn)古霉素腸球菌分離陽(yáng)性率12.4%(21/170)。耐萬(wàn)古霉素運(yùn)動(dòng)腸球菌(鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌)陽(yáng)性1.2%(2/170)，1株腸球菌不明菌種。21株耐萬(wàn)古霉素腸球菌中菌種分布情況：屎腸球菌66.7%(14/21)，糞腸球菌19%(4/21)，鉛黃腸球菌4.8%(1/21), 鶉雞腸球菌4.8%(1/21)，不明菌種4.8%(1/21)。耐萬(wàn)古霉素腸球菌在屎腸球菌中最常見(jiàn)，與多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本研究中，VRE對(duì)大部分檢測(cè)抗菌藥物耐藥率超過(guò)50%，包括環(huán)丙沙星(90.5%)、青霉素(81%)、 氨芐西林(76.2%)、慶大霉素(HLAR 61.9%)。但仍對(duì)米諾環(huán)素(95.2%)與利奈唑胺 (100%)敏感。21株VRE的萬(wàn)古霉素、替考拉寧MIC范圍分別為8μg/mL->512μg/mL、 0.25μg/mL->512μg/mL ，對(duì)萬(wàn)古霉素高水平耐藥的VRE(MIC，64μg/mL-≥1000μg/mL)18 株，對(duì)替考拉寧高水平耐藥的VRE(MIC，16-512 μg/mL)14 株。對(duì)萬(wàn)古霉素與替考拉寧菌高水平耐藥的VRE株14株，萬(wàn)古霉素高水平耐藥但對(duì)替考拉寧敏感(MIC≤8μg/mL)的VRE 4 株。本研究中，鉛黃腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素高水平耐藥，但對(duì)替考拉寧敏感; 鶉雞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素為中介，但對(duì)替考拉寧敏感。

經(jīng)PCR檢測(cè)，21株耐萬(wàn)古霉素腸球菌，18株含vanA型耐藥基因，1株含vanC1型耐藥基因，1株vanC2/C3型耐藥基因，1株耐藥基因不明確。無(wú)vanB型耐藥基因。根據(jù)PCR結(jié)果與藥敏結(jié)果分析，9株vanA基因型與表型相符，2株vanA基因簇表型為萬(wàn)古霉素中介，替考拉寧敏感，7株VanD 表型-vanA基因型；鉛黃腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素高水平耐藥(MIC=512mg/L)，但對(duì)替考拉寧敏感(MIC=4mg/L)，與VanC表型不符; 鶉雞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素為中介( MIC=8mg/L )，但對(duì)替考拉寧(MIC=0.25mg/L)敏感，與VanC表型相符。

本研究中，1株不明菌種且不明耐藥基因型，由于本研究中PCR引物只有屎腸球菌、糞腸球菌及vanC1、vanC2、vanC3對(duì)應(yīng)特異性菌株，耐藥基因型引物僅有vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3,需進(jìn)一步測(cè)定該菌株16S rRNA及其他6種耐藥基因型是否相符,如不相符還應(yīng)對(duì)耐藥型進(jìn)行進(jìn)一步明確，該菌株表型呈VanA表型。進(jìn)行了體外藥敏實(shí)驗(yàn)及PCR檢測(cè)耐藥基因型，僅判斷出VRE的表型及基因型， VanD表型-vanA基因型VRE感染是否能使用替考拉寧治療，仍需要進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以證明。

追蹤VRE定植陽(yáng)性患者，無(wú)VRE感染。我院萬(wàn)古霉素的使用合理，手衛(wèi)生規(guī)范，適當(dāng)隔離與VRE陽(yáng)性患者密切接觸者。因此雖然肛門拭子VRE陽(yáng)性率12.4%，但VRE定植陽(yáng)性患者，VRE感染率為0，尚沒(méi)有出現(xiàn)VRE。國(guó)內(nèi)許多研究報(bào)道多家醫(yī)院已出現(xiàn)了成人VRE，且對(duì)VRE同源性及流行性進(jìn)行了分析報(bào)道[9,17，18]。近些年，隨著萬(wàn)古霉素的大量應(yīng)用，VRE的不斷出現(xiàn)，兒童中也將會(huì)出現(xiàn)VRE[20，21]，因此對(duì)腸球菌的耐藥監(jiān)測(cè)是勢(shì)在必行的。

4 結(jié)論

本文資料顯示，VRE對(duì)利奈唑胺、米諾環(huán)素較敏感，臨床可作為治療兒童VRE感染的選擇藥物。本研究中VanA基因型最常見(jiàn),臨床在使用抗菌藥物治療中應(yīng)予重視。

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