利用體外法研究不同水平黃曲霉毒素B1對(duì)蜀宣花牛瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響

方東輝，付茂忠，唐 慧，甘 佳，王 淮，易 軍，王 巍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）被世界衛(wèi)生組織癌癥機(jī)構(gòu)認(rèn)定為Ⅰ類致癌物（WHO，1993）［1］。在所有黃曲霉毒素中，B1的毒性最強(qiáng)，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性約為氰化鉀的10倍，三氧化二砷的68倍，致癌性為二甲基亞硝胺的75倍，奶油黃的900倍［2］。常見(jiàn)的幾種AF的毒性按大小順序排列依次為 B1＞M1＞G1＞B2＞G2。黃曲霉廣泛存在于自然界，潮濕易發(fā)霉的植物和食品中易滋生。飼料中污染的黃曲霉毒素以B1最多見(jiàn)，毒性和致癌性最強(qiáng)。各種畜禽對(duì)它的敏感性不一樣，其順序大致為仔豬>犢牛>肥育豬>成年牛>綿羊。但奶牛采食的飼料原料種類繁多，而且采食總量也較其他動(dòng)物更多，因而奶牛接觸霉菌毒素的種類及概率高于其他動(dòng)物［3-4］。奶牛采食AFB1污染的飼料后，很少一部分會(huì)在瘤胃中被降解，剩下的大部分AFB1在消化道被吸收，但吸收率相對(duì)較低［4］。進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體的AFB1在肝臟內(nèi)被羥基化成黃曲霉毒素 M1（AFM1）［5-6］。有試驗(yàn)證明，日糧中AFB1轉(zhuǎn)化為乳中AFM1的效率與精料水平關(guān)聯(lián)密切。高產(chǎn)母牛由于飼料采食量大，食入的AFB1多，轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)6%［7］。四川省地處亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季高溫高濕、冬季低溫高濕，更容易導(dǎo)致飼料霉變滋生黃曲霉，從而影響奶牛生產(chǎn)。因此，本試驗(yàn)以濕熱環(huán)境下蜀宣花牛產(chǎn)奶母牛為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)體外培養(yǎng)法研究不同水平的黃曲霉毒素B1對(duì)瘤胃微生物代謝的影響，旨在探究奶牛瘤胃中黃曲霉毒素B1的最大耐受濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇安裝永久性瘤胃瘺管的3頭蜀宣花牛產(chǎn)奶母牛（540 kg±28 kg）作為供體牛開展試驗(yàn)，飼喂 TMR，自由飲水，日糧情況見(jiàn)表1。

表1 TMR日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將TMR飼料烘干粉碎，經(jīng)60目篩制后作為底物，采集供體牛的瘤胃液進(jìn)行體外培養(yǎng)。本研究設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每種處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別為A組（瘤胃液中添加0.1μg/mLB1）、B組（添加1μg/mL B1）、C 組（添加 5μg/mL B1）、D 組（添加 10 μg/mL B1）和cg組（對(duì)照組，不添加），B1由FERMENTEK公司生產(chǎn)。各試驗(yàn)組在體外發(fā)酵裝置中（自研）培養(yǎng)0，2，4，8，12和24 h后取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的pH值、氨態(tài)氮和VFA。

1.3 方法

1.3.1 瘤胃液的采集 晨飼后2 h采集供體奶牛瘤胃液各300mL，置于飽和CO2保溫瓶中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室后用4層紗布過(guò)濾，39℃水浴保溫并持續(xù)通入CO2直至分裝使用。

1.3.2 體外培養(yǎng) 分別精確稱取2.00 g TMR飼料底物于不同組號(hào)的錐形瓶中。用蒸餾水將AFB1溶液稀釋成0.01，0.1，0.5，1.0mg/mL 的溶液，各取 1mL AFB1 稀釋溶液于對(duì)應(yīng)錐形瓶中，對(duì)照組加入1mL蒸餾水。取人工唾液與瘤胃液混合液（人工唾液與瘤胃液比例為2∶1）99mL于各個(gè)錐形瓶中混合均勻，置于39℃的恒溫水浴搖床上培養(yǎng)0，2，4，8，12和24 h，取培養(yǎng)液經(jīng)離心處理后待分析。人工唾液配置參照Menke等［8］方法。

1.3.3 pH值測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束采完氣體樣后用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.3.4 氨態(tài)氮和VFA的測(cè)定 取1.0 mL的發(fā)酵液在4℃下10 000×g離心10min，取上清液加0.3mL的25%（w/v）偏磷酸混勻，4℃靜置 30min，然后 10 000×g離心10min，取上清液待分析。發(fā)酵液中氨態(tài)氮濃度采用靛酚比色法測(cè)定［9］。揮發(fā)性脂肪酸濃度測(cè)定采用氣相色譜法外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定［10］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素ANOVA進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同添加量AFB1對(duì)底物pH值變化的影響

由表2可見(jiàn)，發(fā)酵2 h之前所有試驗(yàn)組pH值均小幅升高，2 h后顯著下降，其中2～4 h的下降速率最大。4 h時(shí)D組pH值極顯著高于其他各組（P<0.01），8 h時(shí)D組pH值也極顯著高于其他各組（P<0.01）。

表2 不同添加水平AFB1對(duì)體外發(fā)酵瘤胃液pH值的影響

瘤胃液pH值的變化受日糧性質(zhì)有機(jī)酸積聚和唾液分泌量的影響，其可反映瘤胃的綜合發(fā)酵水平［11］。pH值隨瘤胃微生物對(duì)發(fā)酵底物的分解產(chǎn)生NH3-N和揮發(fā)性脂肪酸等產(chǎn)物而發(fā)生變化，其正常變化范圍是5.5～7.5，pH值過(guò)高或者過(guò)低對(duì)瘤胃微生物生長(zhǎng)、繁殖及底物發(fā)酵均造成不利的影響。當(dāng)pH值低于下限時(shí)，瘤胃內(nèi)的微生物活力降低，數(shù)量減少或完全被酸性環(huán)境殺死。本試驗(yàn)發(fā)酵8 h內(nèi)，pH值均在5.54～7.51之間，12 h后，各組pH值均處于下限水平。因此，體外發(fā)酵其他指標(biāo)只利用12 h之內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2 不同添加量AFB1對(duì)底物氨氮濃度的影響

由表3可見(jiàn)，添加0.1μg/mL B1后，氨態(tài)氮濃度的變化模式與對(duì)照組基本一致，均為2 h內(nèi)下降，2～8 h緩慢上升，12 h后迅速下降，且各時(shí)間節(jié)點(diǎn)兩組間差異均不顯著（P>0.05）。添加 1μg/mLB1時(shí)，8 h以內(nèi)，氨氮濃度變化模式與對(duì)照組一致，且各時(shí)間節(jié)點(diǎn)兩組間差異也不顯著（P>0.05）；8～12 h，氨氮濃度則出現(xiàn)下降且極限值均低于對(duì)照組（P<0.01）和 A 組（P<0.01）；12～24 h，氨氮濃度無(wú)明顯變化，24 h時(shí)氨氮濃度與對(duì)照組和A組間差異均不顯著（P>0.05）。添加5μg/mLB1時(shí)，2 h以內(nèi)，氨氮濃度變化模式與對(duì)照組一致，且兩組間差異均不顯著（P>0.05）；2～4 h，氨氮濃度上升且顯著高于對(duì)照組（P<0.05）和 A 組（P<0.05）；4～12 h，氨氮濃度下降，12 h的氨氮濃度極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）和A組（P<0.01），顯著低于B 組（P<0.05）；12～24 h，氨氮濃度上升，24 h氨氮濃度與對(duì)照組、A組和B組間差異均不顯著（P>0.05）。添加10μg/mL B1時(shí)，2 h以內(nèi)，氨氮濃度變化模式與對(duì)照組一致，且兩組間差異均不顯著（P>0.05）；2～4 h，氨氮濃度緩慢上升，且極顯著低于B組、C組和對(duì)照組（P<0.01）；4～12 h，氨氮濃度下降，且極顯著低于其它各組（P<0.01）；12～24 h，氨氮濃度上升，24 h氨氮濃度也極顯著低于其他各組（P<0.01）。

氨氮是瘤胃內(nèi)飼料蛋白質(zhì)肽氨基酸氨化物尿素和其他非蛋白氮化合物分解的終產(chǎn)物，同時(shí)又是微生物合成菌體蛋白的主要原料［12］。適宜的NH3-N濃度是瘤胃氮代謝重要的中間環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)氨氮濃度的變化符合瘤胃微生物最佳生長(zhǎng)所需濃度（5～28mg/100mL）的要求［13］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加 1 μg/mLB1 和 5 μg/mLB1時(shí)，氨氮濃度在8 h后均極顯著下降；添加10μg/mLB1時(shí)，氨氮在2 h后極顯著下降。說(shuō)明添加黃曲霉毒素B1會(huì)降低微生物降解蛋白質(zhì)的活性，且隨著B1濃度的升高，微生物降解能力下降的起始時(shí)間節(jié)點(diǎn)逐步提前。

表3 不同添加水平AFB1對(duì)體外發(fā)酵瘤胃液氨氮濃度的影響mg/100mL

2.3 不同添加量AFB1對(duì)揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量的影響

如表4所示，在體外發(fā)酵裝置中培養(yǎng)12 h時(shí)，添加10μg/mLB1組的乙酸濃度顯著低于對(duì)照組（P<0.05），與其余各試驗(yàn)組間均差異不顯著（P>0.05）；各組間丙酸濃度均差異不顯著（P>0.05）；添加10μg/mL組總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著低于對(duì)照組（P<0.05），與其余各組間均差異不顯著（P>0.05）。

有研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃微生物體外靜態(tài)培養(yǎng)中添加不同濃度的AFB1，可減少總揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸產(chǎn)量也逐漸下降（P<0.05）［14］。本研究結(jié)果表明，10μg/mLB1組的VFA濃度較低，說(shuō)明該水平下微生物活性較弱，不利于瘤胃發(fā)酵。Mertens等［15］研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物對(duì)AFB1很敏感，添加AFB1會(huì)擾亂瘤胃微生物的生長(zhǎng)和功能，進(jìn)而會(huì)改變VFA的組成比例。乙酸是由微生物慢速發(fā)酵飼料中纖維物質(zhì)生成的，乙酸含量的高低可反映微生物降解纖維的活性。本研究結(jié)果表明，添加10μg/mL組的乙酸比例較低，因此推測(cè)，10μg/mL水平下纖維分解菌的活性相對(duì)受到抑制。

表4 不同黃曲霉毒素B1添加水平對(duì)體外發(fā)酵12 h混合物VFA濃度的影響mmol/L

3 小結(jié)

（1）本試驗(yàn)結(jié)果表明，4 h和8 h時(shí)添加10μg/mL B1組的pH值均極顯著高于其他各組（P<0.01）。

（2）添加1μg/mLB1和5μg/mLB1時(shí)，氨氮濃度在8 h后極顯著下降，添加10μg/mLB1時(shí)，氨氮在2 h后極顯著下降。說(shuō)明添加黃曲霉毒素B1能夠降低微生物降解蛋白質(zhì)的活性，隨著B1濃度的升高，微生物降解能力下降的起始時(shí)間節(jié)點(diǎn)逐步提前。

（3）添加10μg/mLB1組的VFA濃度較低，說(shuō)明該水平下微生物活性較弱，不利于瘤胃發(fā)酵，且添加10μg/mL B1組的乙酸比例較低，因此推測(cè)，10μg/mLB1水平下纖維分解菌的活性相對(duì)受到抑制。

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