山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的gag基因克隆及分析

侯宏艷，朱德建，張丹俊，胡曉苗，趙瑞宏，戴 銀

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

羊地方性鼻內(nèi)腺癌（Enzootic nasal adenocarcinoma，ENA）是由綿羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（ENTV-1）和山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（ENTV-2）引起的慢性傳染病。ENA呈世界性分布，在法國、意大利、美國、日本、巴西、尼日利亞等國都有綿羊或山羊感染的報道［1-3］。山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤是由ENTV-2引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染?。?］，呈地域性流行，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、鼻漏、鼻腔內(nèi)現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)增生物［4］，雖然發(fā)病率不高，但病死率達(dá)100%，且發(fā)病的多為成年羊［3］，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟損失。近年來，在我國內(nèi)蒙古、湖南、四川、陜西［5-10］等地都有該病的報道，已逐漸引起養(yǎng)羊行業(yè)的重視。

安徽省對該病鮮有報道，臨床上也不多見，作者在臨床上碰到的這起病例在臨床特點及病理損傷方面均與國內(nèi)外報道有高度相似性，為進一步從病原上對該病確診，本研究開展了分子生物學(xué)檢測，以便為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從發(fā)生疑似山羊鼻內(nèi)腫瘤羊場的發(fā)病羊群中選出病羊2例，剖檢后取鼻腔內(nèi)腫瘤組織，剪碎研磨后置-80℃保存?zhèn)溆?。病毒基因組RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，2×Taqmix，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，pMD19-T Vector，質(zhì)粒提取試劑盒，DL2000Marker等均購自上海生物工程有限公司。

1.2 臨床癥狀與剖檢病變

在發(fā)病羊場了解周圍環(huán)境、發(fā)病情況，并沿矢狀切面打開病羊頭骨觀察病變情況。

1.3 分子生物學(xué)檢測

根據(jù)已發(fā)表的GenBank中的已有序列，參照郝中香等［5］的報道，設(shè)計一對gag基因部分片段的特異性引物，P1 5'-AAATGCGACCTTCCGATAATGATGA-3'；P2 5'-CTTCTGTAGCGGGGACATATTCTCA-3'，預(yù)期擴增目的基因片段長度323 bp，由上海生物工程有限公司合成。

取1.1中研磨好的腫瘤組織，用病毒基因組RNA提取試劑盒提取RNA，用RT-PCR試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按說明書進行。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Taqmix 12.5μL，ddH2O 8.5μL，20μM 的上下游引物各1μL，cDNA模板2μL。PCR反應(yīng)條件：95℃變性4min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒對目的條帶回收純化，具體操作按說明書進行。純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-TVector，轉(zhuǎn)化TOP10。陽性克隆質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序，測序結(jié)果通過Blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)和臨床癥狀

該羊場發(fā)病羊均為1歲以上的青年羊及成年羊，先有3只發(fā)病，后又有2只發(fā)病。病羊單側(cè)有大量鼻液流出，鼻液呈灰白狀，漏的一側(cè)面部鼓起，明顯看到兩側(cè)的不同，按壓額骨變軟。

2.2 病理變化

沿矢狀切面打開病羊頭骨可見單側(cè)性的增生物，呈粉紅色結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地柔軟，增生物沿鼻腔生長，使鼻腔閉塞，鼻骨變形。整個鼻腔內(nèi)充滿灰白色的糊狀物，覆蓋在增生物上（圖1）。

2.3 gag部分基因的克隆與序列比對

采用1.3中的引物和方法獲得gag部分基因片段，結(jié)果得到預(yù)期大小的特異性片段，大小約323 bp（圖2）?？寺y序后的基因片段與NCBI已報道的核苷酸序列比對，結(jié)果顯示，得到的序列與NCBI已報道ENTV-2核苷酸序列同源性最高，達(dá)99%，表明該病羊感染了ENTV-2。

圖1 病羊單側(cè)鼻內(nèi)腫物

圖2 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒gag部分基因片段PCR擴增結(jié)果

圖3 獲得的gag部分基因與已報道的核苷酸序列（ID:HM 104174.1）的比對

3 討論

ENTV-2的臨床癥狀和病理剖檢較典型，病羊出現(xiàn)鼻漏、面部腫脹，以及在鼻內(nèi)發(fā)現(xiàn)增生物可作為初期診斷的依據(jù)，進一步診斷可借助特異性強、穩(wěn)定性和重復(fù)性均好的RT-PCR快速檢測方法。本研究調(diào)查了安徽省發(fā)生ENT病羊的癥狀，剖檢病羊后觀察組織病變，并進行了闡述，初步認(rèn)定為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤，另外對病原的gag部分基因片段進行了克隆和序列比對，結(jié)果與NCBI已報道ENTV-2核苷酸序列同源性最高，達(dá)99%，表明該病羊感染了ENTV-2。

ENTV-2引起山羊鼻內(nèi)粘膜上皮細(xì)胞和肺支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，異常增生形成腫瘤。盡管國內(nèi)外學(xué)者在病原方面（包括腫瘤發(fā)生機制及免疫應(yīng)答特點等）進行了深入研究，如謝智勇等［8］對四川發(fā)生的羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的SU基因進行了原核表達(dá)，何亞鵬等［9］對ENTV-2 Shaanxi株SU蛋白進行了原核表達(dá)及多克隆抗體的制備，王彬［10］利用生物信息學(xué)軟件分析了miRNA差異表達(dá)在腫瘤形成中的作用，但都還沒有找到有效的防控措施。針對該病主要還是應(yīng)用RT-PCR方法檢測出感染的山羊，通過淘汰病羊進行羊群的凈化，并注意養(yǎng)羊場的周邊環(huán)境是否符合養(yǎng)殖要求，以避免造成長期的危害。

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