貴州黑山羊魏氏梭菌和鏈球菌雙重感染的診治

陳學(xué)忠

（貴州省關(guān)嶺布依族苗族自治縣草地畜牧業(yè)發(fā)展中心，關(guān)嶺 561300）

羊梭菌性疾病（Clostridiosis of sheep）包括羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝狙、羔羊痢疾和羊黑疫等，是因梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium）中的細(xì)菌感染引起的一類急性傳染病［1］。由魏氏梭菌引起的羊病稱之為魏氏梭菌病，魏氏梭菌（Cl.welchii），又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏陽性菌，屬于腐生性厭氧芽孢致病菌，是引起畜禽猝死癥、腸毒血癥、壞死性腸炎、氣性壞疽的主要致病菌［2］。感染魏氏梭菌后家畜死亡率高達(dá)70%～100%，且不同菌型的魏氏梭菌常混合感染，藥物治療效果不明顯［3-4］。鏈球菌（Streptococcus）為一種呈鏈狀或成對(duì)存在的革蘭氏陽性球菌，多個(gè)種的鏈球菌具有強(qiáng)致病性，常是人獸共患病的病原［5］。在豬、牛、羊等動(dòng)物中，鏈球菌不僅可以引起敗血癥及乳房炎，也是引起肺炎的重要病原性細(xì)菌之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，亦引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年來，山羊養(yǎng)殖業(yè)不斷向規(guī)?；较虬l(fā)展，但各種山羊的傳染病，特別是呼吸道疾病的發(fā)病率不斷上升，給山羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重影響［6］。

2017年9月中旬，貴州某黑山羊養(yǎng)殖戶送臨床癥狀相似的發(fā)病羊3只到關(guān)嶺布依族苗族自治縣畜牧服務(wù)中心實(shí)驗(yàn)室診斷。發(fā)病黑山羊表現(xiàn)為呼吸急促、口吐白沫、體溫升高、大便帶血等。通過臨床癥狀、病理解剖、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和支原體PCR技術(shù)診斷，確診為魏氏梭菌和鏈球菌混合感染。

1 臨床癥狀

發(fā)病羊表現(xiàn)為精神萎靡、呼吸急促、消瘦、磨牙，體溫升高，脈搏每分鐘80～110次，呼吸每分鐘25～35次，并出現(xiàn)獨(dú)處、臥地不愿走動(dòng)，強(qiáng)行驅(qū)趕時(shí)行動(dòng)遲緩，腹部臌脹，有的排糞困難，有的里急后重，大便溏稀，并夾有黏液和脫落的黏膜，間有血絲，隨即口吐大量白色泡沫，很快倒地死亡，發(fā)病母羊6只全部急性死亡。

2 剖檢變化

剖檢發(fā)現(xiàn)病死羊心尖及心耳有瘀斑；肺臟部分出血、水腫（圖1）；真胃胃底黏膜有大面積充血、出血（圖2）；肝臟表面有不同程度的斑塊，邊緣出現(xiàn)梗塞性壞死（圖3）；脾臟腫大，有白色壞死灶（圖4）；腎臟被膜出血，有壞死灶；病死羊肛周粘有帶血絲糞便，各腸段黏膜均有不同程度的充血、出血現(xiàn)象，黏膜組織水腫；腸系膜及肝臟上有數(shù)個(gè)細(xì)頸囊尾蚴（水鈴鐺）。

圖1 肺臟病變及壞死

圖2 真胃黏膜充血、出血

圖3 肝臟邊緣壞死、腫脹

圖4 脾臟腫大、有壞死灶

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集送檢羊的心、肝、脾、肺、腎、血液進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，即接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于37℃、5%CO2需氧/厭氧培養(yǎng)24～48 h。發(fā)現(xiàn)在普通瓊脂平板上有A菌表面光滑、半透明、圓形中央隆起的菌落，且只在厭氧培養(yǎng)中生長(zhǎng)，B菌的菌落較小，在需氧和厭氧環(huán)境中均能生長(zhǎng)。然后再將其單個(gè)菌落接種于血液瓊脂平板上可見A菌呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、中央隆起、灰白色、半透明的大菌落，菌落周圍有棕色溶血環(huán)，有的有雙溶血環(huán)；B菌在血瓊脂平板上生長(zhǎng)好，能長(zhǎng)出灰白色、圓形、透明、閃光、中央隆起、表面光滑露珠狀小菌落，菌落周圍呈β溶血。挑取典型單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢可見到兩端鈍圓的藍(lán)紫色革蘭氏陽性、短粗的桿菌（圖5）和革蘭氏陽性鏈狀球菌（圖6）。

圖5 10×100倍油鏡下革蘭氏陽性桿菌

圖6 10×100倍油鏡下革蘭氏陽性球菌

3.2 細(xì)菌的生化特性鑒定

將分離純化的細(xì)菌在無菌條件下分別進(jìn)行葡萄糖、甘露醇、甘露糖、N乙酰葡胺、木糖醇、蕈糖、精氨酸水解、果糖、木糖、硝酸鹽、蔗糖、蔗糖、尿素、山梨醇、乳糖、麥芽糖等發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，硫化氫實(shí)驗(yàn)，靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)和含鐵牛乳實(shí)驗(yàn)。其中有A菌可以發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，硫化氫實(shí)驗(yàn)呈陽性，靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)呈陰性，明膠液化實(shí)驗(yàn)為陽性，但不發(fā)酵木糖、甘露醇、山梨醇，在含鐵牛乳實(shí)驗(yàn)中，分解乳糖產(chǎn)酸，出現(xiàn)“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。符合梭菌的生化指標(biāo)。B菌可以發(fā)酵果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，葡萄糖實(shí)驗(yàn)呈陽性，木糖醇實(shí)驗(yàn)呈陰性，硝酸鹽實(shí)驗(yàn)為陰性。符合鏈球菌的生化指標(biāo)。

3.3 支原體的PCR檢測(cè)

無菌解剖采集2只死亡病羊的肺臟，適量取樣研磨后反復(fù)凍融3次，勻漿器磨20min后收集勻漿，12 000 r/min離心10min，取上清，并與采集的病死羊血液一起分別提取DNA（按支原體PCR檢測(cè)核酸提取試劑盒使用說明書）。用支原體PCR檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR核酸檢測(cè)。反應(yīng)體系（總體積 20μL）：16μL PCR 反應(yīng)液，2μL Taq DNA 聚合酶，2μL 模板 DNA。PCR 擴(kuò)增程序：94℃ 3min；94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸 10min。反應(yīng)結(jié)束后取5μLPCR產(chǎn)物于1%的1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)（90 V，35min），用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。其結(jié)果為：病料中未檢測(cè)出支原體特異性陽性條帶，表明發(fā)病羊無支原體感染。

4 確診

根據(jù)臨床診斷、病理解剖診斷、細(xì)菌染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化鑒定及支原體病毒核酸PCR檢測(cè)，確診發(fā)病黑山羊?yàn)殒溓蚓c魏氏梭菌的混合感染。

5 治療

針對(duì)魏氏梭菌和鏈球菌感染，建議發(fā)病羊場(chǎng)首先對(duì)發(fā)病羊隔離飼養(yǎng)，并對(duì)全群免疫羊三聯(lián)四防疫苗；免疫時(shí)，不論羊個(gè)體大小一律肌肉注射或皮下注射1mL，注射后14 d產(chǎn)生免疫力，免疫期1年。用青霉素配磺胺類藥治療為主，早期治療每次使用青霉素的量為80萬～160萬IU，肌肉注射，每天2次；使用磺胺類藥物治療時(shí)按40～60mg/kg，首次加倍，并給每只羊開以下中藥處方：黃連5 g，黃芩5 g，梔子5 g，黃柏5 g，銀花5 g制粉水煎15min飼喂調(diào)理，同時(shí)用黃芪多糖肌肉注射，以增強(qiáng)其免疫力，嚴(yán)重患病羊只直接淘汰。針對(duì)細(xì)頸囊尾蚴的感染，對(duì)糞便進(jìn)行發(fā)酵處理，以殺死幼蟲；每月驅(qū)蟲，皮下注射阿維菌素0.2mg/kg或0.6mg/kg混飼。另外，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理，保持地面整潔，做好圈舍的預(yù)防消毒，保障供給清潔飲水。改善飼養(yǎng)環(huán)境，避免擁擠而相互攻擊；減少圍欄粗糙墻面，避免擦傷。特別注意保持母羊舍環(huán)境的清潔、干燥，盡可能安排在春、秋天氣溫暖干燥的季節(jié)產(chǎn)仔，可減少病菌的感染。根據(jù)以上方法治療控制后，新發(fā)病羊只明顯減少，對(duì)該羊場(chǎng)發(fā)病起到了一定的控制作用，2個(gè)月后該羊場(chǎng)未見新病例。

羊魏氏梭菌病無明顯季節(jié)性，在人工飼養(yǎng)條件下，由于飼料、換季、環(huán)境等突然變化及與人接觸，導(dǎo)致羊抗病力下降，腸道菌群失調(diào)，羊感染魏氏梭菌后導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降進(jìn)而繼發(fā)感染鏈球菌，并且這兩種病菌有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，從而引起魏氏梭菌和鏈球菌混合感染。用燒堿水對(duì)污染的圈舍和四周水溝等環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，消毒藥品至少要有2種以上含有不同成分的藥物交替使用，以免產(chǎn)生耐藥性；同時(shí)合理搭配飼料，增強(qiáng)羊機(jī)體抗病能力，還要加強(qiáng)管理，保證食物衛(wèi)生，營(yíng)養(yǎng)均衡。

［1］ 陳溥言.動(dòng)物傳染病學(xué)［M］.5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：315-320.

［2］ 孟霞，孫翠平，唐娜，等.一株山羊魏氏梭菌的分離鑒定及其致病性研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（7）：1905-1909.

［3］ 羅毅.奶牛魏氏梭菌病病原的分離鑒定鑒定［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2011，28（8）：61-62.

［4］ 陳小平，李施鐘.山羊魏氏梭菌混合感染的防治［J］.云南畜牧獸醫(yī)，2008（5）：27.

［5］ Keith E R，Murdoch D R.Antimicrobial susceptibility profile of Streptococcus pseudopneumoniae isolated from sputum［J］.Antimicrobial Agents&Chemotherapy，2008，52（8）：2998.

［6］ 謝珊珊，刀筱芳，祝存錄，等.山羊源鏈球菌的分離鑒定及其藥物敏感性分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（15）：171-173.