HBVpreC/C區(qū)基因突變與原發(fā)性肝癌預(yù)后的關(guān)系

吳忱思 吳建華 趙樂(lè) 王英南 張風(fēng)賓 張衛(wèi)國(guó) 張瑞星

050011石家莊,河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科(吳忱思、趙樂(lè)、王英南、張風(fēng)賓、張瑞星),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(吳建華)；050011石家莊,河北醫(yī)科大學(xué)《臨床薈萃》編輯部(張衛(wèi)國(guó))

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率第5位的常見(jiàn)惡性腫瘤,每年約有70萬(wàn)人死于肝癌,該病易復(fù)發(fā)、預(yù)后差,其死亡率位居惡性腫瘤第2位[1]。目前,HCC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,有研究表明,肝臟炎癥程度、腫瘤病理類型、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小和脈管瘤栓,是評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[2-3]。在亞洲和非洲,肝細(xì)胞肝癌患病率呈逐年上升趨勢(shì),其主要和這些區(qū)域乙型肝炎病毒感染流行有關(guān),在亞洲,肝癌約80%以上是由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所致。因此,HBV與HCC之間的關(guān)系已成為原發(fā)性肝癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

HBV是一種嗜肝病毒,據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球每年大約有100萬(wàn)人死于其感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。根據(jù)乙型肝炎病毒的全基因序列差異(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536),已經(jīng)鑒定出了A～J 10個(gè)基因型,其中,在東亞,HBV主要為B和C基因型[4]。在我國(guó),HBV感染率高,大約9 300萬(wàn)人是HBV攜帶者,3 000萬(wàn)人患有慢性乙型病毒性肝炎[5]。HBV基因組包含四個(gè)重疊的開(kāi)放讀碼框(open reading frame,ORF),即P、X、pre S/S、pre C/C 基因區(qū),分別編碼聚合酶蛋白、X蛋白、外膜蛋白和核殼蛋白。由于缺少HBV聚合酶的校正,HBV DNA非常容易發(fā)生基因突變[6-7]。HBV基因突變與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系已經(jīng)被廣泛研究[8-11],但是HBV基因突變與HBV-HCC預(yù)后關(guān)系的研究則相對(duì)較少。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)基本核心啟動(dòng)子(the basal core promoter,BCP)區(qū)域的A1762T/G1 764 A突變與乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后相關(guān),本研究擴(kuò)展到HBV preC/C區(qū)基因,探討其突變位點(diǎn)與HCC預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 收集肝癌組織標(biāo)本和提取HBV DNA81例癌組織標(biāo)本均來(lái)自于2007—2009年在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的HBV-HCC患者。標(biāo)本采集經(jīng)患者或家屬知情同意?；颊吣挲g30～86歲,其中女性患者10例,男性患者71例,中位年齡54歲,患者均排除其他肝臟疾病(如自身免疫性肝炎、HCV感染等)并被證實(shí)感染HBV。實(shí)驗(yàn)過(guò)程經(jīng)過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用Promega公司DNA試劑盒提取基因組DNA,并置于-20℃冰箱備用。

1.2 PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序應(yīng)用Life Technologies公司的ABI 7300 TaqMan平臺(tái),通過(guò)多重PCR法測(cè)出HBV-HCC患者癌組織的HBV基因型。并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536)查找引物(見(jiàn)表1),對(duì) HBV preC/C區(qū)的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,將其產(chǎn)物純化處理后進(jìn)行測(cè)序分析。采用雙向重復(fù)測(cè)序方法對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier、Logrank test、和Cox回歸分析對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。所有的統(tǒng)計(jì)處理操作均應(yīng)用IBM公司的SPSS 18.0軟件,Ρ＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HBV preC/C區(qū)基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物Tab.1 Primers used in PCR amplification and sequencing in the preC/C region gene

2 結(jié)果

2.1 HBV-HCC患者的臨床特征對(duì)接受手術(shù)治療的81例HBV-HCC患者術(shù)后進(jìn)行隨訪,時(shí)間為3年,每3個(gè)月隨訪1次,將其進(jìn)行基因分型如下：46例為B型,35例為C型。分析其臨床特征與術(shù)后生存期之間的關(guān)系,結(jié)果顯示門脈瘤栓、腫瘤分期和腫瘤大小與HBV-HCC患者的生存相關(guān)(見(jiàn)表2)。并將以上3個(gè)因素引入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型,進(jìn)行多因素方差分析,結(jié)果顯示門脈瘤栓、腫瘤分期和腫瘤大小被確定為與HBV-HCC患者術(shù)后生存相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 HBV-HCC患者的臨床因素Tab.2 The analysis of clinical factors in HBV-HCC patients

2.2 HBV preC/C區(qū)基因突變與生存的相關(guān)性本研究對(duì)HBV preC/C區(qū)的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序。使用Log-rank test和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析HBV突變與HBV-HCC生存之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)18個(gè)位點(diǎn)的突變頻率大于5%(見(jiàn)表3),應(yīng)用Log-rank test和Kaplan-Meier進(jìn)行分析,在這18個(gè)位點(diǎn)中,7個(gè)位點(diǎn)(1915、2134、2176、2221、2260、1979、2245)與HBV-HCC患者術(shù)后生存相關(guān)。如表3所示,以下5個(gè)突變位點(diǎn)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,被確定為預(yù)測(cè)HBV-HCC患者生存相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子：1915位點(diǎn)(P=0.024),2134位點(diǎn)(P=0.006),2176位點(diǎn)(P=0.002),2221位點(diǎn)(P=0.001)和2260位點(diǎn)(P=0.016)。另外,1979和2245突變位點(diǎn)與HCC患者的生存具有臨界統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：1979位點(diǎn)(P=0.098),2245 位點(diǎn)(P=0.052)。 將 1915、2134、2176、2221、2260和2245位點(diǎn)與臨床因素相關(guān)聯(lián)進(jìn)行多因素方差分析,由于1979位點(diǎn)P值較大故未引入進(jìn)行多因素方差分析,結(jié)果顯示 1915位點(diǎn)(RR：0.195,95%CI：0.044～0.855,P=0.030)存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而2 221 位點(diǎn)(RR：2.815,95%CI：0.918 ～8.632,P=0.070)存在臨界統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表4)。

表3 與HBV-HCC術(shù)后患者生存相關(guān)的HBV preC/C區(qū)基因突變位點(diǎn)Tab.3 HBV preC/Cregion mutations associated with postoperative survival in HBV-HCCpatients

表4 與HBV-HCC術(shù)后患者生存相關(guān)的臨床特征與HBV preC/C區(qū)基因突變位點(diǎn)Tab.4 Multivariate analysis of clinical characteristics with postoperative survival in HBV-HCCpatients and the HBV preC/Cregion mutations

3 討論

HBV屬嗜肝DNA病毒科,HBV非常容易發(fā)生基因突變。既往研究發(fā)現(xiàn)HBV突變主要集中在HBV基因組的特定區(qū)域,例如基本核心啟動(dòng)子BCP區(qū)、pre S/S區(qū)和pre C/C區(qū)[13]。本研究重點(diǎn)觀察HBV DNA序列中HBV preC/C區(qū),研究該區(qū)域基因突變位點(diǎn)與HBV-HCC預(yù)后的關(guān)系,并通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析鑒定出與HBV-HCC生存相關(guān)的7個(gè)突變位點(diǎn)。結(jié)果表明,HBV preC/C區(qū)基因突變不僅與HCC發(fā)生有關(guān),也與HCC患者術(shù)后生存相關(guān)。

目前,HBV感染在東南亞地區(qū)非常普遍,已經(jīng)成為威脅人群健康的主要問(wèn)題[14]。HBV preC/C區(qū)基因是HBV四個(gè)ORF之一,其主要編碼乙型肝炎e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)和核心蛋白。BCP區(qū)中的突變G1 896 A和A17 62T/G1 764 A雙突變,可使HBeAg表達(dá)下降[15]。在過(guò)去的幾年中,有研究明確了導(dǎo)致HCC的兩個(gè)HBV突變位點(diǎn)[16-17]。其中,G1 896 A和C2 288 A可以引起氨基酸殘基的突變。然而,只有G1 896 A已經(jīng)被深入地研究,G1 896 A突變導(dǎo)致preC/C區(qū)基因第28位密碼子由TGG變?yōu)榻K止密碼子TAG,通過(guò)該突變可以將終止密碼子引入preC/C區(qū)基因的開(kāi)放閱讀框,從而阻止HBeAg的產(chǎn)生,并且研究顯示該突變與肝癌發(fā)生相關(guān)[17]。HBV preC/C區(qū)基因共同編碼HBeAg,HBeAg可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,其抗體在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著清除HBV的作用,Gl896 A突變使得preC基因不能與C基因共同編碼轉(zhuǎn)譯出完整的HBeAg,從而導(dǎo)致病毒逃逸機(jī)體對(duì)病毒的免疫清除作用[18-19]。Kim等[12]證實(shí)可以引起密碼子突變的HBV preC/C區(qū)基因突變位點(diǎn)與HCC相關(guān),該研究結(jié)果還表明,在HBV preC/C基因區(qū),除了G1 896 A導(dǎo)致密碼子突變與HCC相關(guān)之外,仍然存在與HCC相關(guān)的突變位點(diǎn)。因此,為了深入研究HCC相關(guān)的突變位點(diǎn)及其作用機(jī)制,需要從人體試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室水平進(jìn)一步驗(yàn)證并闡明。

本研究中,在HBV preC/C區(qū)基因中鑒定出了與HBV-HCC生存相關(guān)的7個(gè)突變位點(diǎn)：1915,2134,2176,2221,2260,1979和2245。這些突變位點(diǎn)在肝癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。Rajesh等人在對(duì)印度北部HBV感染者基因型研究中也發(fā)現(xiàn)了A19 15G突變。Akuta等[21]研究發(fā)現(xiàn)C基因區(qū)2134位點(diǎn)突變可作為判斷HBV抗病毒藥物治療是否有效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。荊永正等人[22]研究發(fā)現(xiàn)乙型病毒性肝炎患者C222 1T突變出現(xiàn)在C基因區(qū),未導(dǎo)致氨基酸突變,為同義突變。C基因編碼HBc Ag(hepatitis B virus c antigen,HBcAg),它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,HBcAg表達(dá)于肝細(xì)胞膜表面,C基因的突變可導(dǎo)致HBcAg抗原位點(diǎn)改變,從而形成細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對(duì)HBcAg的識(shí)別逃逸,這是HBV感染肝細(xì)胞后清除病毒及造成肝損傷的重要機(jī)制之一[23]。近年來(lái),多項(xiàng)研究表明程序性死亡因子l(programmed death 1,PD-1)和程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)是參與腫瘤免疫逃逸的重要環(huán)節(jié),且與T淋巴細(xì)胞免疫功能缺陷相關(guān),HBcAg可以通過(guò)JNK、ERK和P13 K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)PD-1的高表達(dá),而高表達(dá)的PD-l促進(jìn)HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡和抑制其抗病毒功能[24]。并且大量研究表明HCC腫瘤組織中PDL1表達(dá)水平顯著升高[25-26]。PD-1與PD-L1結(jié)合后可導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡,從而引起免疫逃逸狀態(tài),促進(jìn)HCC的形成[27]。本研究對(duì)于HBV DNA突變位點(diǎn)的研究分析,鑒定出與HCC預(yù)后關(guān)聯(lián)的HBV preC/C區(qū)基因突變位點(diǎn),為肝癌的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn),有利于鑒別預(yù)后不良的肝癌患者,及早進(jìn)行治療及干預(yù),對(duì)于提高肝癌患者的生存期、改善其預(yù)后具有重要的意義。

利益沖突無(wú)