一種新型HIV-1 DNA檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

李龍 杜聰 趙芳凝 徐斌 鄭敏娜 李宗娜 周寧 龔卉 郭燕 程紹輝 于茂河

300011天津市疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制室(李龍、趙芳凝、鄭敏娜、周寧、龔卉、郭燕、程紹輝、于茂河)；300400天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司(杜聰、徐斌、李宗娜)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的致病因子[1]。HIV是一種雙鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒,進(jìn)入人體后選擇性入侵人體免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組DNA中,形成前病毒。隨后以前病毒為模板,利用宿主細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄、剪切、蛋白翻譯、包裝等機(jī)制生產(chǎn)更多的HIV病毒顆粒并釋出細(xì)胞外。如此周而復(fù)始,感染更多的CD4+T淋巴細(xì)胞[2]。HIV感染的診斷是艾滋病預(yù)防控制工作要解決的首要問(wèn)題。要確認(rèn)是否感染HIV病毒,可以通過(guò)檢測(cè)HIV的病毒核酸、抗體、抗原、或病毒分離培養(yǎng)等方法。而DNA檢測(cè)在艾滋病早期診斷以及抗病毒治療后患者的HIV-1潛伏細(xì)胞群即病毒儲(chǔ)藏庫(kù)內(nèi)前病毒的監(jiān)測(cè)中具有重要意義[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外尚未見單獨(dú)檢測(cè)HIV DNA的同類試劑上市,各實(shí)驗(yàn)室采用的方法多為內(nèi)部科研方法,方法的標(biāo)準(zhǔn)化程度不夠,缺乏可比性。本研究是對(duì)一種新型HIV-1 DNA檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià),為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源2017年4～11月,天津市疾病預(yù)防控制中心艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室依照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》2015版[5]進(jìn)行檢測(cè)判斷的結(jié)果為HIV抗體陽(yáng)性樣品59例,陰性樣品36例,HIV抗原抗體診斷試劑檢測(cè)陽(yáng)性且對(duì)比試劑1(Western blot,WB確證試劑)檢測(cè)結(jié)果不確定的樣本17例,弱陽(yáng)性標(biāo)本1例,特異性標(biāo)本8例。所有樣本均為全血樣本,進(jìn)行盲法編號(hào)后-30℃凍存。標(biāo)本采集獲得患者或家屬知情同意。

I/II型人類嗜T細(xì)胞病毒(HTLV-I/II)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A)、EB病毒(EBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、抗核抗體(ANA)、類風(fēng)濕因子(RF)特異性樣本各1份,由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供,本實(shí)驗(yàn)室用特異診斷試劑進(jìn)行復(fù)核。

1.2 主要試劑人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA檢測(cè)試劑盒(PAP核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光PCR法)為天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司研制(批號(hào)：09H13Q)；對(duì)比試劑1：人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗體蛋白印跡試劑盒,MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd.(批號(hào)：AE6028)；對(duì)比試劑 2：人類免疫缺陷病毒1型核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光法)雅培貿(mào)易(上海)有限公司(批號(hào)：478846)；人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒,北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：H20161010)

1.3 實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果判定

1.3.1 感染狀態(tài)判定：依照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》2015版進(jìn)行檢測(cè),使用確證試劑(對(duì)比試劑1)判斷樣品的感染狀態(tài),對(duì)于確證結(jié)果為不確定的樣本,進(jìn)行隨訪檢測(cè),隨訪檢測(cè)仍為不確定的以核酸結(jié)果判斷感染狀態(tài)。特異性樣本采用經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)注冊(cè)有證產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)復(fù)核。

1.3.2 HIV-1 DNA檢測(cè)：盲法編號(hào)的樣本解凍吸取200μl全血進(jìn)行基因組DNA提取,操作按照說(shuō)明書(QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit)進(jìn)行,注意需要延長(zhǎng)蛋白酶K的消化時(shí)間至2～4 h,以徹底清除各種蛋白質(zhì)類抑制物。將已提取好的DNA樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別加入1組檢測(cè)孔(2孔/組)中,每孔分別加入17μl。加樣結(jié)束后蓋緊蓋子并震蕩混勻,離心去除氣泡。按照說(shuō)明書設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)程序(96 ℃ 2 min,1個(gè)循環(huán)；96 ℃ 12 s、60 ℃ 30 s、64℃ 30 s、68℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)),將八聯(lián)管置于熒光PCR儀(BioRad CFX96)中,待反應(yīng)結(jié)束后讀取各樣本的Ct值,Ct≤39判定為陽(yáng)性,Ct＞39判定為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果解盲后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法主要分析指標(biāo)：以HIV感染狀態(tài)(樣品的HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果)為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn),分析考核試劑的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%的置信區(qū)間,并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)考核試劑和HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。次要分析指標(biāo)：以HIV感染狀態(tài)(樣品的HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果)為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn),分析考核試劑和對(duì)比試劑2的陽(yáng)性檢出例數(shù),陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%的置信區(qū)間,并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)考核試劑和對(duì)比試劑2檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1DNA試劑檢測(cè)結(jié)果與HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果比較本次實(shí)驗(yàn)共入選97例,最終取得有效結(jié)果并納入統(tǒng)計(jì)95例(有兩例樣本經(jīng)隨訪檢測(cè)結(jié)果為不確定且核酸檢測(cè)失敗)。結(jié)果見表1,考核試劑陽(yáng)性符合率為100%(59/59),95%CI：93.94% ～100%；陰性符合率為 100%(36/36),95%CI：90.26% ～100%；總符合率為100%(95/95),95%CI：96.19% ～100%；Kappa值為 1,95%CI：1.00 ～1.00,表明考核試劑檢測(cè)結(jié)果與抗體檢測(cè)結(jié)果(HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果)一致。

表1 HIV-1DNA試劑檢測(cè)結(jié)果與樣品的HIV-1感染狀態(tài)結(jié)果比較(n)Tab.1 Comparison of HIV-1 DNA test results and HIV-1 infection status of samples(n)

2.2 HIV-1DNA試劑檢測(cè)結(jié)果與RNA定量檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果比較對(duì)比檢測(cè)試劑2與考核試劑在檢測(cè)結(jié)果上出現(xiàn)差異,結(jié)果見表2,考核試劑陽(yáng)性符合率為100%(41/41),95%CI：(91.40% ～100%)；陰性符合率為76.74%(33/43),95%CI：(61.37%～88.24%)；總符合率為 88.10%(74/84),95%CI：(79.19% ～94.14%),Kappa值為0.736,95%CI：(0.629～0.897)。

表2 HIV-1DNA試劑檢測(cè)結(jié)果與對(duì)比試劑2檢測(cè)結(jié)果比較(n)Tab.2 Comparison of the results of HIV-1DNA reagent and reference reagent 2(n)

2.3 弱陽(yáng)性,不確定,特異性樣本結(jié)果分析

2.3.1 HIV-1DNA試劑對(duì)于弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性驗(yàn)證：HIV-1抗體弱陽(yáng)性樣本(復(fù)檢抗體檢測(cè)OD0.229)共入選1例,結(jié)果見表3,按照規(guī)范進(jìn)了補(bǔ)充試驗(yàn),對(duì)比試劑1(WB檢測(cè)試劑)結(jié)果為不確定,隨訪檢測(cè)仍為不確定。首次檢驗(yàn)樣本對(duì)比試劑2(RNA定量)檢測(cè)結(jié)果為：37 544拷貝/ml。對(duì)于弱陽(yáng)性樣本考核試劑檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,與對(duì)比試劑2檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3.2 考核試劑對(duì)于HIV抗原抗體檢測(cè)陽(yáng)性且對(duì)比試劑1(WB確證試劑)檢測(cè)結(jié)果陰性的檢測(cè)：共入選10例,最終取得有效結(jié)果并納入統(tǒng)計(jì)10例,考核試劑檢測(cè)結(jié)果均為陰性,對(duì)比試劑2(RNA檢測(cè)試劑)結(jié)果均為陰性,對(duì)比試劑1(WB確證試劑)結(jié)果均為陰性,三者結(jié)果一致。

2.3.3 HIV抗原抗體檢測(cè)陽(yáng)性且對(duì)比試劑1(WB確證試劑)檢測(cè)結(jié)果不確定的樣本：共入選17例,最終取得有效結(jié)果并納入統(tǒng)計(jì)15例(有兩例樣本經(jīng)隨訪檢測(cè)結(jié)果為不確定且RNA檢測(cè)失敗)。這15例不確定標(biāo)本通過(guò)隨訪檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,或?qū)Ρ仍噭?(RNA檢測(cè)試劑)檢測(cè)結(jié)果數(shù)值＞5 000拷貝/ml。考核試劑檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,考核試劑檢出率100%。

2.3.4 特異性樣本檢測(cè)驗(yàn)證：共入選8例,最終取得有效結(jié)果并納入統(tǒng)計(jì)8例,使用考核試劑及對(duì)比試劑1(WB確證試劑)、對(duì)比試劑2(RNA檢測(cè)試劑)進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)考核試劑的特異性；考核試劑及對(duì)比試劑1結(jié)果為陰性,對(duì)比試劑2檢測(cè)結(jié)果有一例檢測(cè)失敗其余為未檢出(表4)。

3 討論

本試劑盒采用以焦磷酸化激活的聚合反應(yīng)(pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)[6]為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增HIV-1前病毒的高度保守區(qū)域,同時(shí)采用熒光標(biāo)記的引物發(fā)出實(shí)時(shí)熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV-1 DNA和內(nèi)源性人類基因組DNA總量的檢測(cè)。該試劑為定性試劑,其特殊的PAP法通過(guò)使用特異阻斷性引物,把焦磷酸化反應(yīng)和聚合反應(yīng)串聯(lián)耦合而達(dá)到最佳效果,具有超高的靈敏度和選擇性,使用血樣標(biāo)本即可檢測(cè)宿主細(xì)胞中被整合的HIV病毒基因,可以從摻雜的10億個(gè)幾乎完全相同的核酸分子(包括DNA和RNA)中直接特異性地?cái)U(kuò)增出1個(gè)拷貝的靶基因。

表3 1份弱陽(yáng)性樣本檢測(cè)驗(yàn)證Tab.3 Verification for one weakly positive sample

表4 8份特異性樣本驗(yàn)證Tab.4 Verification for eight specific samples

該試劑在對(duì)于感染早期的不確定標(biāo)本檢測(cè)中顯示出一定的優(yōu)勢(shì),在15例不確定標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,而這15例標(biāo)本通過(guò)隨訪檢測(cè)確證結(jié)果為陽(yáng)性,或?qū)Ρ仍噭?(RNA檢測(cè)試劑)檢測(cè)結(jié)果數(shù)值＞5 000拷貝/ml?？己嗽噭z出率100%。另外該試劑在假陽(yáng)性、特異性標(biāo)本檢測(cè)中顯示出良好的特異性。在10例HIV抗原抗體檢測(cè)陽(yáng)性且對(duì)比試劑1(WB確證試劑)檢測(cè)結(jié)果陰性,證實(shí)該試劑可有效排除四代試劑產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果。在8例特異性標(biāo)本的檢測(cè)中,考核試劑及對(duì)比試劑1結(jié)果一致,無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。

對(duì)比檢測(cè)試劑2與考核試劑在檢測(cè)結(jié)果上出現(xiàn)差異,考核試劑陽(yáng)性符合率為100%,陰性符合率為76.74%,總符合率為 88.10%,所得Kappa值為0.736。調(diào)查樣本的流行病學(xué)資料,分析其原因?yàn)榧{入統(tǒng)計(jì)的樣本患者已經(jīng)接受了抗病毒治療,經(jīng)過(guò)抗病毒治療后血漿中HIV-1 RNA降至低于檢測(cè)下限[7],而感染者的血液、精液或淋巴結(jié)中仍有大量HIV-1前病毒DNA存在,構(gòu)成病毒儲(chǔ)藏庫(kù)[8-9]。所以出現(xiàn)了部分樣品考核試劑檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而對(duì)比試劑2結(jié)果為陰性。對(duì)比檢測(cè)試劑2出現(xiàn)了多例檢測(cè)失敗,原因可能為HIV-1 RNA對(duì)樣本質(zhì)量要求較高,容易受到樣本中血紅蛋白、三酰甘油的影響,對(duì)于發(fā)生嚴(yán)重溶血的樣本無(wú)法完成檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)血紅蛋白濃度為97 g/L時(shí)HIV RNA和試劑內(nèi)標(biāo)質(zhì)控均未被檢出[10],而DNA檢測(cè)試劑對(duì)樣本質(zhì)量兼容性更高,成功完成了檢測(cè)。

本研究表明,考核試劑檢測(cè)結(jié)果與HIV-1感染狀態(tài)一致,可以認(rèn)為與現(xiàn)在我國(guó)所采用的HIV-1檢測(cè)試劑等效,且能有效鑒別出感染早期的不確定標(biāo)本。與進(jìn)口RNA定量檢測(cè)試劑盒相比,能有效的檢測(cè)出接受抗病毒治療患者的病毒儲(chǔ)藏庫(kù)中HIV-1 DNA,具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突無(wú)