蝦夷扇貝糖胺聚糖的提取及降血脂活性的研究

欒君笑，劉雨博，佟長(zhǎng)青，李 偉，金 橋

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis） 屬軟體動(dòng)物門扇貝科，是我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖貝類品種，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其干制的扇貝柱更是高檔的海產(chǎn)品。蘇秀榕等人[1]研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝含有18種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸含量較高。辛世剛等人[2]研究表明扇貝富含K，Ca，Mg，F(xiàn)e，Zn，Cu，Co，Mn等對(duì)人體有益的微量元素。此外，扇貝還含有豐富的多不飽和脂肪酸，特別是二十碳五烯酸（EPA） 和二十二碳六烯酸（DHA），二者約占多不飽和脂肪酸的73.55%[3]。

近年來研究表明，扇貝體內(nèi)含有氨基多糖、活性肽、多不飽和脂肪酸、維生素、?；撬岬榷喾N生理活性成分[4]。氨基多糖又稱糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG），是由含氨基己糖和己糖醛酸的重復(fù)復(fù)合單位聚合形成的長(zhǎng)鏈不分枝多糖，普遍存在于動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，是細(xì)胞間質(zhì)的重要組成部分[5]。海洋貝類的糖胺聚糖具有抗腫瘤[6-8]、抗凝血[9-11]、抗氧化[12-14]、抗病毒[15-16]、抗疲勞[17]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保護(hù)肝損傷等生物活性。蝦夷扇貝糖胺聚糖（PYG）是蝦夷扇貝的主要生物活性成分，但目前尚沒有蝦夷扇貝糖胺聚糖降血脂活性的相關(guān)研究報(bào)道。試驗(yàn)旨在研究蝦夷扇貝糖胺聚糖提取過程中各因素的作用，通過響應(yīng)曲面法確定最優(yōu)提取工藝條件，并研究蝦夷扇貝糖胺聚糖的降血脂活性，試驗(yàn)結(jié)果可為有效開發(fā)和利用蝦夷扇貝資源提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis），購(gòu)自大連漁大叔海洋食品有限公司，冰柜冷凍備用；木瓜蛋白酶（1∶100 000）、胰蛋白酶（1∶250），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?～8周雄性昆明小鼠，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，于通風(fēng)良好標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖條件室內(nèi)暫養(yǎng)。

儀器：BS-110S型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；UV-1750型紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州） 有限公司產(chǎn)品；GL-21M型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；Waters 600E型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；FTS-175C型紅外光譜儀，Bio-Rad Win公司產(chǎn)品；ZS-200型自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海新嘉電子有限公司產(chǎn)品；Multiskan FC型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蝦夷扇貝糖胺聚糖的提取工藝流程

蝦夷扇貝全臟器用組織搗碎機(jī)勻漿，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶按4∶3比例混合，在45℃，pH值7.5條件下進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后將酶解液煮沸使酶滅活，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液進(jìn)行等電點(diǎn)除雜蛋白，干燥后即為蝦夷扇貝糖胺聚糖粗品。通過酶添加量、料液比和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)后，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用阿利新藍(lán)比色法進(jìn)行糖胺聚糖含量的測(cè)定。

1.2.2 蝦夷扇貝糖胺聚糖提取工藝的單因素試驗(yàn)

選擇料液比、酶添加量和酶解時(shí)間3個(gè)影響因素，設(shè)置不同水平，按1.2.1方法提取蝦夷扇貝糖胺聚糖，研究其對(duì)糖胺聚糖提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化蝦夷扇貝糖胺聚糖提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Benhken響應(yīng)面法，以蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率為響應(yīng)值，在三因素三水平上優(yōu)化提取條件。酶添加量、料液比、酶解時(shí)間3個(gè)因素分別用A，B，C表示，并以+1，0，-1代表變量的水平，按照方程對(duì)自變量進(jìn)行編碼，用Design expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

1.2.4 蝦夷扇貝糖胺聚糖降血脂活性的研究

將72只小鼠隨機(jī)分成6組，分別為正常組、高血脂模型組、辛伐他丁陽(yáng)性對(duì)照組，蝦夷扇貝糖胺聚糖低、中、高劑量組。每天以0.1 mL/10 g·bw灌胃1次，蝦夷扇貝糖胺聚糖低、中、高劑量組分別灌胃蝦夷扇貝糖胺聚糖100，200，400 mg/kg·d，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃辛伐他丁0.2 mg/kg·d，正常組、模型組灌胃等量生理鹽水；每次給藥約1 h后，除正常組外各組均投放事先配制的高脂飼料，連續(xù)給予高脂飼料至試驗(yàn)結(jié)束。于末次灌胃后，禁食不禁水24 h后摘除眼球取血，離心得血清，測(cè)定血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）含量。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用X±s來表示，多組比較采用無重復(fù)雙因素分析進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 料液比對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

在復(fù)合酶添加量為1.0%（質(zhì)量比），酶解時(shí)間2.5 h的條件下，研究料液比對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響。

料液比對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

由圖1可看出，當(dāng)料液比小于1∶4時(shí)，料液比越大，提取率越高。當(dāng)料液比為1∶4時(shí)，糖胺聚糖的提取率達(dá)到最大。

2.1.2 酶添加量對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

酶添加量對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響見圖2。

在料液比1∶4，酶解時(shí)間2.5h的條件下，研究酶添加量對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響。由圖2可看出，隨著酶添加量的提高，糖胺聚糖提取率逐漸升高，當(dāng)酶添加量大于1.5%后提取率略微下降。綜合考慮糖胺聚糖提取率與生產(chǎn)成本，確定復(fù)合酶添加量以1.5%為最佳。

圖2 酶添加量對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響

在料液比1∶4，酶添加量1.5%的條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率的影響。由圖3可看出，糖胺聚糖的提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在酶解2.5 h后提取率有所下降。酶解時(shí)間對(duì)糖胺聚糖提取率影響較大，若時(shí)間過短，蛋白質(zhì)降解不完全，組織內(nèi)的糖胺聚糖沒有得到充分釋放；若時(shí)間過長(zhǎng)，蛋白酶又可能水解部分糖胺聚糖，綜合考慮確定酶解時(shí)間以2.5 h為最佳。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Benhken響應(yīng)面法，以酶添加量（A）、料液比（B）、酶解時(shí)間（C）為自變量，糖胺聚糖提取率為響應(yīng)值（Y），對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及糖胺聚糖提取率見表2。

運(yùn)用Design expert 8.0軟件整理試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，擬合得到蝦夷扇貝糖胺聚糖提取試驗(yàn)的回歸方程為：Y=1.84-0.11A-0.04B+0.036C+0.15AB-0.072AC-0.02BC-0.3A2-0.68B2-0.31C2。

回歸模型的方差分析及誤差分析見表3，模型的可信度分析見表4。

由表3可知，對(duì)糖胺聚糖提取率所建立的回歸模型是極顯著的，而試驗(yàn)失擬項(xiàng)則不顯著，這表明試驗(yàn)方案是可靠的。各一次項(xiàng)的p值均小于0.05，表明一次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響顯著，交叉相AB、AC的p值小于0.05，表明其具有一定的交互作用。各二次項(xiàng)的p值均小于0.05，說明二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有顯著影響。由表3可看出，在試驗(yàn)所選的各因素水平范圍內(nèi)，各影響因素的主次順序依次為料液比（B）＞酶解時(shí)間（C） ＞酶添加量（A）。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及糖胺聚糖提取率

表3 回歸模型的方差分析及誤差分析

表4 模型的可信度分析

由表4可知，回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.998 6，校正相關(guān)系數(shù)為0.996 8，表明糖胺聚糖提取率的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值之間具有較高的擬合相關(guān)性；表中Y的變異系數(shù)數(shù)值較低，說明試驗(yàn)具有較高的可靠性；信噪比數(shù)值較大，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c試驗(yàn)結(jié)果能夠很好地響應(yīng)。因此，可利用該回歸模型確定最佳提取工藝。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析及最佳提取條件確定

根據(jù)回歸方程擬合及回歸分析結(jié)果做出2個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。

酶解時(shí)間與酶添加量交互作用的響應(yīng)面見圖4，料液比與酶添加量交互作用的響應(yīng)面見圖5，酶解時(shí)間與液料比交互作用的響應(yīng)面見圖6。

圖4 酶解時(shí)間與酶添加量交互作用的響應(yīng)面

圖5 料液比與酶添加量交互作用的響應(yīng)面

圖6 酶解時(shí)間與液料比交互作用的響應(yīng)面

由圖4～圖6可看出，3個(gè)響應(yīng)曲面圖均為凸形曲面，開口向下，表明響應(yīng)值（Y）存在最大值，響應(yīng)面圖的曲面傾斜角度越陡峭，表明2個(gè)因素的交互作用越顯著，而曲面傾斜角度越平坦，表明2個(gè)因素的交互作用越微弱。通過軟件優(yōu)化，模擬得最佳提取條件為酶添加量1.44%，料液比1∶4，酶解時(shí)間2.54 h，預(yù)測(cè)提取率為1.877%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際提取率為1.873%，與預(yù)測(cè)值基本相符，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取蝦夷扇貝糖胺聚糖是可行的，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)作用。

2.4 蝦夷扇貝糖胺聚糖降血脂活性研究

2.4.1 粗制品精制結(jié)果與分析

糖胺聚糖粗制品經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析，收集速率為3 min/管，收集量為3 mL/管。收集樣品采用阿利新藍(lán)比色法測(cè)定糖胺聚糖含量，繪制洗脫曲線可見呈單峰。凍干后進(jìn)行紅外光譜掃描，根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]對(duì)蝦夷扇貝糖胺聚糖紅外光譜圖進(jìn)行分析，可以看出譜圖中含有糖類的-OH（3 440 cm-1），-CH3（2 930 cm-1），C-O-C（1 036 cm-1），-NH（1 654 cm-1）， -COO- （1 408 cm-1）， -OSO3-（1 242 cm-1），這些均為氨基多糖的特征基團(tuán)。另外，譜圖顯示在950～1 250 cm-1有強(qiáng)吸收峰，表明該多糖的單糖組成為吡喃單體。綜上所述，蝦夷扇貝糖胺聚糖的圖譜顯示其具有典型的糖胺聚糖特征吸收峰，為具有吡喃型糖環(huán)的氨基多糖。

蝦夷扇貝糖胺聚糖的紅外光譜見圖7。

圖7 蝦夷扇貝糖胺聚糖的紅外光譜

2.4.2 蝦夷扇貝糖胺聚糖降血脂活性研究

蝦夷扇貝糖胺聚糖對(duì)高血脂小鼠血脂水平的影響見表5。

由表5可知，高脂模型組與空白對(duì)照組比較，TC，TG，HDL，LDL含量差異均極顯著，表明小鼠高血脂模型造模成功。與模型組比較，蝦夷扇貝糖胺聚糖中、高劑量組均能顯著降低高血脂小鼠血清中的 TC，TG，LDL-C水平 （p＜0.05 或 p＜0.01），高劑量組顯著增大高血脂小鼠血清中的HDL-C水平（p＜0.05），且高劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較p＞0.05，無顯著性差異，上述結(jié)果表明蝦夷扇貝糖胺聚糖對(duì)高血脂小鼠具有較好的降血脂作用。高劑量組的蝦夷扇貝糖胺聚糖能使高血脂小鼠血清中的TC，TG，LDL-C水平分別降低35.38%，31.07%，22.58%，使HDL-C水平升高41.18%。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)曲面法建立酶添加量、料液比、酶解時(shí)間3個(gè)因素與蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率相互作用的模型：Y=1.84-0.11A-0.04B+0.036C+0.15AB-0.072AC-0.02BC-0.3A2-0.68B2-0.31C2。各影響因素的主次順序依次為料液比＞酶解時(shí)間＞酶添加量?；貧w模型的方差分析表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，試驗(yàn)方案可靠。通過響應(yīng)面法優(yōu)化，得出蝦夷扇貝糖胺聚糖的最佳提取工藝為酶添加量1.44%，料液比1∶4，酶解時(shí)間2.54 h，在此條件下蝦夷扇貝糖胺聚糖提取率為1.873%。

表5 蝦夷扇貝糖胺聚糖對(duì)高血脂小鼠血脂水平的影響

蝦夷扇貝糖胺聚糖中、高劑量組均能顯著降低高血脂小鼠血清中的TC，TG，LDL-C水平（p＜0.05或p＜0.01），高劑量組顯著增大高血脂小鼠血清中的HDL-C水平（p＜0.05），高劑量組的蝦夷扇貝糖胺聚糖能使高血脂小鼠血清中的TC，TG，LDL-C水平分別降低35.38%，31.07%，22.58%，使HDL-C水平升高41.18%，試驗(yàn)結(jié)果表明蝦夷扇貝糖胺聚糖對(duì)高脂模型小鼠具有較好的降血脂作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇秀榕，李太武，丁明進(jìn).扇貝營(yíng)養(yǎng)成分的研究 [J].海洋科學(xué)，1997（2）：10-11.

[2]辛世剛，王瑩，趙娜，等.扇貝微量元素的測(cè)定 [J].光譜學(xué)與光譜分析，2007（10）：2 120-2 122.

[3]李偉青，王頡，孫劍鋒，等.海灣扇貝營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià) [J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011（6）：630-632.

[4]黃翠麗，劉賽.扇貝的生理活性物質(zhì)和藥用價(jià)值 [J].中國(guó)海洋藥物，2001，80（2）：45-47.

[5]王長(zhǎng)云，管華詩(shī)，李八方.氨基多糖研究概況與展望[J].生物工程進(jìn)展，1995，15（6）： 2-10.

[6]李瑞，吳紅棉，范秀萍，等.翡翠貽貝糖胺聚糖體外抑制CNE-2Z腫瘤生長(zhǎng)作用的研究 [J].現(xiàn)代食品科技，2010，26 （5）：437-440.

[7]劉倩，范秀萍，吳紅棉，等.尖紫蛤糖胺聚糖抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用的研究 [J].食品研究與開發(fā)，2012，28（4）：396-399.

[8]胡雪瓊，吳紅棉，范秀萍，等.珠母貝糖胺聚糖抗腫瘤作用初步研究 [J].食品工業(yè)科技，2013，34（22）：315-319.

[9]袁春營(yíng)，崔青曼，孫會(huì)芳，等.四角蛤蜊糖胺聚糖的分離純化及功能活性研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（10）：5 882-5 884.

[10]吳紅棉，雷曉凌，洪鵬志，等.珠母貝糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)初探及其生理活性 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25（2）：166-170.

[11]于運(yùn)海，周大勇，朱蓓薇，等.蝦夷扇貝臟器硫酸酯多糖的制備及性質(zhì)研究 [J].食品科學(xué)，2009，30（6）：68-71.

[12]董曉靜，范秀萍，吳紅棉，等.波紋巴非蛤糖胺聚糖抗氧化作用的研究 [J].食品工業(yè)科技，2012，33（6）：181-184.

[13]范秀萍，吳紅棉，王婭楠，等.4種貝類糖胺聚糖體外清除自由基活性的比較 [J].食品科技，2008（2）：165-167.

[14]李孟婕，范秀萍，吳紅棉，等.翡翠貽貝糖胺聚糖的體外抗氧化活性研究 [J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（7）：759-762.

[15]李萌，杜國(guó)威，劉賽，等.牡蠣糖胺聚糖小鼠體內(nèi)抗病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)海洋藥物，2008，27（2）：50-52.

[16]于囡，劉賽，韓建建，等.扇貝糖胺聚糖對(duì)I型單純皰疹病毒的抑制作用 [J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，44 （2）：111-113.

[17]劉勇軍，李江濱，侯敢，等.翡翠貽貝提取物對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究 [J].食品研究與開發(fā)，2006，27（2）：126-129.

[18]姚新生.天然藥物化學(xué) [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：75-80.◇