TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)DIO 小鼠脂肪局部RAS激活機(jī)制

王梅 麥旭東 鄧興鋒 孫嘉 陳宏

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2內(nèi)分泌科，3消化內(nèi)科（廣州 510280）

慢性炎癥是肥胖導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、糖尿病、脂肪肝等疾病的主要因素，脂肪細(xì)胞是肥胖致炎作用的主要途徑［1］。腎臟、心臟、脂肪組織等許多組織部位存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）成分，包括腎素、血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）和血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）［2-3］。脂肪組織存在局部RAS系統(tǒng)，參與局部組織的炎癥反應(yīng)，但活體肥胖狀態(tài)下激活脂肪組織局部RAS系統(tǒng)的確切機(jī)制尚未明確。

Toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）是Toll樣受體（Toll like receptor，TLRs）家族中的一員，是一種病原相關(guān)模塊識(shí)別受體。TLR4可以與配體結(jié)合后激活絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)通路［4-6］。在細(xì)胞水平研究中有證據(jù)表明肝細(xì)胞中存在TLR4和血管緊張素Ⅱ相互作用，并參與肝臟炎癥的發(fā)生［7］，而心肌細(xì)胞中激活TLR4信號(hào)通路可激活RAS［8］。脂肪細(xì)胞RAS系統(tǒng)研究中，細(xì)胞水平研究證實(shí)3T3-L1脂肪細(xì)胞存在TLR4通路并且能被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所激活［9-10］。本研究選取6周齡雄性C57BL/6小鼠高脂飲食喂養(yǎng)14周構(gòu)建DIO小鼠動(dòng)物模型，予TLR4阻斷劑 TAK-242（Resatorvid），非諾貝特（fenofibrate）分別治療DIO小鼠，檢測(cè)小鼠皮下脂肪的RAS成份、TLR4受體表達(dá)情況，在動(dòng)物水平探討TLR4信號(hào)通路與脂肪組織局部RAS激活的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6小鼠33只，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證編號(hào)為：NO.44002100005087），體重（17.2 ± 0.3）g，飼養(yǎng)條件：在恒定的溫度（24℃）和12 h光/暗周期的SPF（specific pathogen free）動(dòng)物級(jí)實(shí)驗(yàn)室（南方醫(yī)科大學(xué)，廣州）。

1.1.2 試劑和儀器 高脂飼料（MD12033）購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；普通飼料購于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；非諾貝特（fenofibrate）購于法國利博福尼制藥公司；TAK-242（Resatorvid）購于上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司）；試劑盒：RNAiso Reagent（TaKaRa，Janpan），ELISA Kit（TaKaRa，Janpan）；引物購于上海生工生物工程有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），油紅O染料購于美國sigma公司；全自動(dòng)生化分析儀（深圳市庫貝爾生物科技有限公司）。其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 建立飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型及藥物治療6周齡雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)正常飼料1周后，分為正常飲食組（normal diet，ND，n=5）和高脂飲食組（high-fat diet，HFD，n=28），喂養(yǎng)14周，每周稱重。正常飲食包含20%kcal來源于脂肪，60%kcal來源于蛋白質(zhì)，20%kcal來源于碳水化合物。高脂飲食主要包含60%kcal來源于脂肪，20%kcal來源于蛋白質(zhì)，20%kcal來源于碳水化合物。21周齡時(shí)選定體重超過正常飲食組平均體重20%的小鼠為肥胖小鼠。將符合要求的小鼠重新隨機(jī)分為肥胖空白組（obesity，OB，n=5），非諾貝特治療組（fenofibrate，F(xiàn)F，n=5）、TAK-242治療組（TAK-242，TAK，n=5）。FF組予100 mg/（kg·d）治療2周，TAK組腹腔注射TAK242，3 mg/（kg·d）治療2周。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 23周齡各組小鼠頸椎脫臼處死前禁食12 h，心臟取血，離心留取血清后，-20℃冰箱保存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各標(biāo)本的三酰甘油（triglyceride，TG），游離脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)游離脂肪酸 小鼠處死后小心切除皮下白色脂肪和肝臟，稱重。取等質(zhì)量肝臟組織后，按照小鼠游離脂肪酸ELISA Kit說明書的步驟用檢測(cè)標(biāo)本游離脂肪酸含量。

1.2.4 油紅O染色觀察皮下脂肪、肝臟組織切片 油紅O染色法分別對(duì)脂肪組織、肝臟組織染色，并用PBS洗滌3次。再用4%的甲醛溶液固定。PBS再洗滌2次后，取適量新制的改良油紅O染色劑染色30 min，顯微鏡下開始作動(dòng)態(tài)觀察。若鏡下觀察到脂肪滴顏色逐漸加深，呈鮮紅的、大小不一的串珠樣時(shí)，即可吸盡油紅O染液終止染色，并用磷酸鹽緩沖液小心漂洗后，加入蘇木素液淡染胞核，再次予PBS漂洗，在鏡下顯微成像觀察。

1.2.5 RT-PCR （1）細(xì)胞總RNA的抽提：按照TaKaRa公司RNAiso Reagent說明書提取總RNA，分裝后置-80℃冰箱保存待用；（2）檢測(cè)RNA完整性：取1.5 μL RNA樣品，drop one紫外分光光度儀檢測(cè)260 nm和280 nm處的OD值，OD260/280比值在1.8～2.0之間，說明RNA純度較高；（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將1 μg模板RNA、250 μmol/L隨機(jī)引物加入反應(yīng)體系，按照說明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20℃冰箱保存待用；（4）RT-PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)引物：血管緊張素原基因引物上游5′-CTGCTCCAGGCTTTCGTCTA-3′，下游：5′AACTGGGTCAGTGGATAAATCC-3′；血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）基因引物：上游5′-CGGTATCCGAATCTGAATGT-3′，下游5′-GCCCCAATCCTACTGTTAGT-3′；TLR4基因引物：上游5′-ACCTGGAATGGGAGGACAAT-3′，下游 5′-GTCCAAGTTGCCGTTTCTTG-3′；GAPDH 為內(nèi)參基因引物：上游：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3′，下游：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′；以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所得cDNA為模板，用上、下游引物PCR擴(kuò)增目的片段。參照說明書建立Real-time PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃10 s、60℃20 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，55℃45 s，95℃15 s。據(jù)溶解曲線判斷引物特異性，單峰說明引物特異性佳，多峰說明引物特異性差，需重新設(shè)計(jì)引物；（5）據(jù)ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有定量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合則多組間比較采用單因素方差分析的LSD法進(jìn)行多重比較；不符合則多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-WallisH方法，若檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P＜0.05），再進(jìn)行多組間兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠各項(xiàng)生理基礎(chǔ)指標(biāo)比較 OB組、FF組、TAK組各組小鼠體重、皮下脂肪重量與正常飲食組比較，有明顯差異。OB組TG、血清NEFA含量較正常飲食組明顯升高。予非諾貝特治療后，F(xiàn)F組小鼠肝內(nèi)NEFA及ALT、AST含量較OB組高，且小鼠肝臟重量顯著增加，皮下脂肪質(zhì)量和TG含量均較OB組明顯降低，而血清NEFA含量并沒有明顯變化。予TAK-242治療后，TAK組肝內(nèi)NEFA含量降低，余數(shù)據(jù)無明顯改變。見表1，圖1。

表1 各組小鼠各項(xiàng)生理及代謝指標(biāo)比較Tab.1 Physiological and metabolic changes of the groups ±s

表1 各組小鼠各項(xiàng)生理及代謝指標(biāo)比較Tab.1 Physiological and metabolic changes of the groups ±s

注：OB組、TAK組、FF組與正常飲食組比較，*P＜0.05，△P＜0.001；TAK組、FF組與OB組比較，▲P＜0.05，☆P＜0.001

體重（g）肝臟重量（g）皮下脂肪重量（g）血清TG（mmol/L）血清NEFA（mmol/L）肝內(nèi)NEFA（nmol/g）ALT（U/L）AST（U/L）正常飲食組27.5±0.5 1.3±0.17 0.08±0.01 0.86±0.04 0.32±0.01 1 126.4±98.4 29.20±5.81 68.90±10.98肥胖空白組（OB）33.9±1.5△1.1±0.07 2.4±0.61△1.51±0.27*0.82±0.07△1 607.7±30.4*35.19±8.69 70.50±11.11 P值0.000 0.151 0.000 0.034 0.000 0.001 0.139 0.892 TAK-242治療組（TAK）30.9±0.7△1.1±0.11 1.88±1.12 1.21±0.35 0.76±0.05 1 073.9±75.3☆32.23±9.32 66.90±15.29 P值0.000 0.147 0.228 0.686 0.101 0.000 0.492 0.563非諾貝特治療組（FF組）29.7±0.5*2.5±0.31☆1.01±0.52▲0.781±0.16▲0.88±0.06 2 402.8±259.4▲60.14±7.89▲95.56±13.12▲P值0.003 0.000 0.005 0.011 0.152 0.013 0.001 0.008

圖1 血清及肝臟組織中游離脂肪酸含量Fig.1 Concentration of NEFA in liver and serum

2.2 脂肪組織和肝臟組織RAS成分表達(dá)變化脂肪組織中，OB組小鼠AT1R、AGT表達(dá)量均顯著高于正常飲食組，給予TAK-242藥物治療后，TAK組小鼠AT1R，AGT表達(dá)量均明顯低于OB組；給予非諾貝特治療后的FF組小鼠AT1R、AGT表達(dá)量較OB組均無明顯改變。在肝臟組織中，OB組小鼠AT1R、AGT表達(dá)量對(duì)比正常飲食組升高不明顯，但予TAK-242藥物治療后，能明顯下調(diào)AT1R表達(dá)量；予非諾貝特組治療后，F(xiàn)F組小鼠AT1R、AGT，TLR4表達(dá)量對(duì)比正常飲食組均明顯升高。見圖2。

2.3 脂肪組織和肝臟組織TLR4受體表達(dá)變化脂肪組織中，OB組小鼠TLR4表達(dá)量顯著高于正常飲食組，予TAK-242藥物治療后，TAK組小鼠TLR4表達(dá)量顯著低于OB組；給予非諾貝特治療后的FF組小鼠TLR4表達(dá)量較OB組有下降趨勢(shì)。在肝組織中，OB組小鼠TLR4表達(dá)量同樣高于正常飲食組，TAK組小鼠TLR4表達(dá)量沒有明顯改變；而非諾貝特干預(yù)后的FF組小鼠TLR4表達(dá)量較OB組高。見圖3。

2.4 脂肪組織和肝臟組織油紅O染色 圖4A示200×高倍視野下正常飲食組小鼠肝臟切片未見肝臟脂肪沉積，OB組小鼠肝臟可見有沉積的脂肪小滴，TAK-242組小鼠肝臟脂肪小滴略少，F(xiàn)F組小鼠肝臟沉積的脂肪小滴比OB組大。圖4B示200×高倍視野下正常飲食組小鼠脂肪組織脂肪細(xì)胞較小，OB組與TAK組小鼠脂肪細(xì)胞明顯增大，而FF組小鼠脂肪組織中脂肪細(xì)胞與OB組相比堆積較少。見圖4。

圖2 脂肪組織和肝臟組織RAS成分表達(dá)變化Fig.2 Expression of local rennin-angiotensin system in adipose and liver tissues

圖3 脂肪組織和肝臟組織TLR4受體表達(dá)變化Fig.3 Expression of local rennin-angiotensin system in adipose and liver tissues

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在心臟、血管壁、脂肪等局部組織或細(xì)胞表達(dá)的RAS稱為局部RAS，RAS主要的效應(yīng)分子為AngⅡ，其由AGT經(jīng)過腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等催化生成，并通過旁分泌或自分泌主要結(jié)合AT1R發(fā)揮作用，并且與系統(tǒng)RAS相互影響，與多種疾病密切相關(guān)［5］。TLR4是一種病原相關(guān)模塊識(shí)別受體，介導(dǎo)激活NF-κB 炎癥反應(yīng)相關(guān)通路［4-6］。前期研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞具有完整的RAS成分，TLR4受體激動(dòng)劑LPS能夠激活3T3-L1脂肪細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路，通路激活后能夠刺激脂肪細(xì)胞RAS成分表達(dá)增加分泌更多AGT和AngⅡ，預(yù)先予AT1R受體阻滯劑厄貝沙坦預(yù)處理，能阻斷RAS的作用，提示LPS所致的TLR4-NF-κB的激活包含激活RAS后AngⅡ/AT1R的致炎作用［10］?；铙w小鼠中NEFA與胎球蛋白A（Fetuin-A，F(xiàn)et-A）結(jié)合體（NEFA/Fetuin-A）是激活TLR4信號(hào)通路的關(guān)鍵［11］。前期研究還發(fā)現(xiàn)3T3-L1脂肪細(xì)胞在Fet-A存在的前提下，NEFA中的棕櫚酸（palmitic acid，PA）能夠上調(diào)表達(dá)AngⅡ、AGT、AT1R，并且該作用能被TLR4阻斷劑TAK-242和NF-κB阻斷劑BAY117082所抑制，證實(shí)NEFA/TLR4-NF-κB信號(hào)通路是脂肪組織局部RAS激活的重要信號(hào)通路［12］。

我們研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠喂養(yǎng)高脂飼料14周后，小鼠整體表現(xiàn)出DIO的特點(diǎn)：體重明顯增加，高甘油三脂血癥，高游離脂肪酸血癥，皮下脂肪大量堆積，肝臟脂肪含量增加。在肥胖的狀態(tài)下，未經(jīng)藥物治療的小鼠脂肪組織的AGT、AT1R、TLR4 mRNA均明顯高于正常飲食對(duì)照組，RAS成分AGT、AT1R和TLR4受體表達(dá)量升高，說明肥胖可導(dǎo)致RAS系統(tǒng)成分高表達(dá)［13］，活體小鼠脂肪組織存在局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)，并可在肥胖狀態(tài)下被激活。

肥胖小鼠脂肪中RAS成分及TLR4受體表達(dá)量確有升高，激活TLR4信號(hào)通路可能從配體及受體兩方面同時(shí)影響脂肪組織RAS，但兩者相互作用如何，需要進(jìn)一步證實(shí)。TLR4受體抑制劑TAK-242是一種TLR4信號(hào)通路小分子抑制劑，通過cys747結(jié)合TLR4胞內(nèi)段TIR結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮作用［14-15］。予TAK組小鼠腹腔注射TAK-242 3 mg/（kg·d）持續(xù)治療2周后，AGT、AT1R、TLR4表達(dá)量均明顯降低。說明TLR4阻斷劑可能一方面直接阻斷TLR4配體受體結(jié)合作用，阻斷TLR4通路，另一方面可能通過抑制TLR4受體表達(dá)量，從而下調(diào)RAS成分的表達(dá)。我們首次在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上發(fā)現(xiàn)阻斷TLR4配體受體結(jié)合作用是下調(diào)脂肪組織局部RAS成分表達(dá)的關(guān)鍵。

圖4 脂肪組織和肝臟組織油紅O染色（×200）Fig.4 Oil-Red-O staining of liver and adipose tissues

研究表明過氧化物酶增殖體激活受體α（PPARα）基因能負(fù)向調(diào)節(jié)TLR4受體表達(dá)［16］。激活PPARα，調(diào)節(jié)血脂TG、NEFA可能影響TLR4信號(hào)通路，從而影響RAS成分的表達(dá)。非諾貝特是氯貝丁酸衍生物類血脂調(diào)節(jié)藥，通過激活PPARα，激活脂解酶和減少載脂蛋白CIII合成，使血漿中脂肪降解和三酰甘油清除明顯增加。我們發(fā)現(xiàn)FF組小鼠TG明顯降低，而血清中NEFA并沒有明顯下降，這可能與藥物增加脂肪組織中脂質(zhì)氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)［17］。在脂肪組織中，TLR4受體表達(dá)量有下降趨勢(shì)，然而RAS成分AGT、AT1R并沒有明顯改變，說明在脂肪組織中通過激活PPARα從而抑制TLR4受體表達(dá)量對(duì)RAS成分表達(dá)作用并不明顯。

皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織具有不同的分子、細(xì)胞和解剖特征［18］，同時(shí)肝臟是體內(nèi)脂肪代謝重要樞紐。有研究表明TLR4-RAS參與肝臟炎癥的發(fā)生［5］，且在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）模型小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟中TLRs受體通過NF-κB通路，上調(diào)TNF-α等炎癥因子［19］。因此我們還觀察小鼠藥物治療后肝臟組織中局部RAS成分變化。小鼠肝臟組織RAS成分及TLR4受體均有所升高，予TLR4阻斷劑治療后，除AT1R表達(dá)量下調(diào)外，AGT、TLR4無明顯改變。此外，非諾貝特干預(yù)后肝內(nèi)NEFA的含量增加，AGT、AT1R、TLR4表達(dá)量亦增加。說明肝組織內(nèi)RAS成分激活途徑與皮下脂肪組織激活途徑可能不同，非諾貝特可能通過增加NEFA與Fet-A結(jié)合體該配體的含量，影響肝臟組織中局部RAS成分表達(dá)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

本研究首次利用TLR4抑制劑（TAK-242，Resatorvid）在動(dòng)物水平探討局部RAS成分激活與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系，為脂肪組織局部RAS與相關(guān)疾病關(guān)系的動(dòng)物水平研究提供依據(jù)。但是本研究局限于單一的Toll樣受體及信號(hào)通路，未從多方面多通路探討TLRs與脂肪組織局部RAS激活的作用機(jī)制。本課題擬下一步實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步探討RAS成分激活與TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游分子的關(guān)系，以及探討不同TLRs對(duì)不同組織局部RAS成分激活的影響。

綜上所述，DIO狀態(tài)下可通過TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)激活脂肪組織RAS系統(tǒng)，TAK-242特異性的阻斷TLR4信號(hào)通路，能下調(diào)RAS成分表達(dá)，提示抑制TLR4配體受體結(jié)合作用是阻斷脂肪組織局部RAS激活的重要途徑。TLR4/NF-κB信號(hào)通路可作為揭示肥胖患者慢性炎癥發(fā)病機(jī)制研究的切入點(diǎn)，為將來對(duì)肥胖慢性炎癥研究提供依據(jù)。

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