VEGF 、HSP 70和NBNA 評分與新生兒窒息的相關(guān)性

王幽夢 魯利群 屈藝

1成都醫(yī)學(xué)院（成都610500）；2成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科（成都610500）；3四川大學(xué)華西第二醫(yī)院（成都610000）

新生兒窒息是臨床常見的新生兒缺氧性疾病，也是引起新生兒死亡的主要因素之一。其不僅能誘導(dǎo)腦細胞缺氧性凋亡的發(fā)生，還會遺留嚴重的神經(jīng)后遺癥，如腦癱、智力低下等，給家庭帶來了巨大的負擔［1］。研究［2］顯示，我國新生兒窒息發(fā)生率為1.03%～12.6%。當前對于診斷新生兒窒息缺乏統(tǒng)一的標準，臨床常用的Apgar評分帶有濃烈的主觀性，且受各方面因素影響，不能客觀地判斷新生兒窒息的嚴重程度及其遠期預(yù)后，因此研究與新生兒窒息嚴重程度有關(guān)的因子對預(yù)后評估及神經(jīng)修復(fù)具有重要的意義。目前國內(nèi)外有關(guān)細胞因子在缺血缺氧組織中的表達的研究很多，但尚未發(fā)現(xiàn)與新生兒窒息密切相關(guān)或高度特異性的細胞因子。近年來研究顯示［3］血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP 70）可參與窒息新生兒體內(nèi)的血流重新分配，增加這些重要器官的血流量，以保證其氧供及物質(zhì)代謝的需要。目前尚未見有關(guān)于VEGF、HSP 70和NBNA評分與新生兒窒息相關(guān)性的報道，有待進一步研究。本研究通過檢測血清中VEGF、HSP 70的表達水平，并比較VEGF、HSP 70和NBNA評分與新生兒窒息的相關(guān)性，旨在為臨床提供更有意義的參考價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 經(jīng)我院倫理委員會批準，納入2012年5月至2017年5月在本院產(chǎn)科出生的足月新生兒138例，輕度室息52例，重度室息36例，另隨機選取Apgar評分正常的新生兒50例為對照組。納入標準：胎齡：37～42周；體質(zhì)量2 500～4 000 g。排除遺傳代謝性疾病及先天性心臟病患兒。抽取所有血樣本前患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及ELISA檢測 各組新生兒生后立即抽取臍動脈血2 mL，靜置30 min，溫度控制在22～27℃，3℃下以3 000 r/min離心10 min，-80℃冰箱儲存血清待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測3組血清中VEGF、HSP 70的表達水平。所有檢測步驟均按照ELISA試劑盒進行操作。

1.2.2 臨床窒息診斷標準 參照2016年新生兒窒息診斷的專家共識［4］：（1）輕度窒息：Apgar評分1 min≤7分或 5 min≤7分，伴臍動脈血pH＜7.2；（2）重度窒息：Apgar評分 1 min≤3分或 5 min≤5分，伴臍動脈血pH＜7.0；（3）補充說明：未取臍動脈血氣分析結(jié)果的，Apgar評分≤7分列為輕度窒息，Apgar評分≤3分列為重度窒息。

1.2.3 NBNA評分 分別于新生兒生后第7、14、28天行NBNA測定。測查均在兩次喂奶之間進行，在新生兒睡眠狀態(tài)下進行評分，室溫保持在24～26℃，室內(nèi)環(huán)境安靜、半暗，需要的輔助工具有長方形紅色塑料盒、小紅球和手電筒各一個，時間控制在12 min以內(nèi)。評分者曾參加過NBNA學(xué)習班并考核通過。NBNA評分標準參照鮑秀蘭教授的評分標準［5］，以評分結(jié)果＜35分判定可能有神經(jīng)行為異常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料以例描述，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以±s描述，多組間比較采用方差分析，各組間的兩兩比較采用t檢驗；應(yīng)用pearson相關(guān)分析進行相關(guān)性分析；通過計算AUC值進一步分析臍血中VEGF、HSP 70對新生兒窒息預(yù)測的特異度及靈敏度。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 3組新生兒性別、出生體重、生產(chǎn)方式、胎齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 一般資料比較Tab.1 The comparison of general data ±s

表1 一般資料比較Tab.1 The comparison of general data ±s

組別對照組輕度窒息組重度窒息組χ2/F值P值例數(shù)50 52 36男/女30/20 28/24 19/17 0.571 0.751順16 22 14剖宮產(chǎn)34 30 22 1.184 0.553出生體重（g）3 028±135.10 3 120±317.21 3 095±279.26 1.746 0.178胎齡（周）38.9±1.31 38.5±1.04 38.3±1.28 2.834 0.062

表2 各組新生兒VEGF、HSP 70表達水平及NBNA評分比較Tab.2 The Comparison of VEGF,HSP 70 expression level and NBNA score in each group ±s

表2 各組新生兒VEGF、HSP 70表達水平及NBNA評分比較Tab.2 The Comparison of VEGF,HSP 70 expression level and NBNA score in each group ±s

注：VEGF為血管內(nèi)皮生長因子、HSP 70為熱休克蛋白70

組別對照組輕度窒息組重度窒息組F值P值VEGF（pg/mL）105±12.54 246±22.40 415±95.34 387.113＜0.001例數(shù)50 52 36 NBNA評分（分）第7天36.16±1.72 33.28±2.48 32.67±1.33 41.520＜0.001第14天37.56±1.29 36.18±2.30 36.16±1.72 9.119＜0.001第28天37.86±0.76 37.18±0.89 36.56±0.70 28.282＜0.001 HSP 70（ng/mL）12.8±1.93 15.2±2.61 18.1±3.72 39.197＜0.001

2.2 各組新生兒VEGF、HSP70表達水平及NBNA評分比較 3組新生兒ELISA檢測結(jié)果顯示，比較血清中VEGF、HSP 70表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中窒息組血清中VEGF水平高于對照組，重度窒息組高于輕度窒息組（P＜0.05）；窒息組血清中HSP 70水平高于對照組，重度窒息組高于輕度窒息組（P＜0.05）。不同時間段3組新生兒NBNA評分比較，對照組評分均高于輕度窒息組及重度窒息組，重度窒息組評分最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 血清中VEGF、HSP 70表達水平與第7、14、28天NBNA評分的相關(guān)性分析 血清中VEGF、HSP 70表達水平與第7、14、28天NBNA評分均呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組血清中VEGF、HSP 70表達水平與第7、14、28天NBNA評分的相關(guān)性Tab.3 The correlation between the expression level of VEGF HSP70 in serum and the NBNA score on the 14th day in each group

2.4 血清中VEGF、HSP70對新生兒窒息的靈敏度及特異度 3組臍血中VEGF、HSP 70預(yù)測新生兒窒息的 AUC值分別為 0.873（95%CI:0.771～0.892，P＜0.001）和 0.815（95%CI:0.729～0.871，P＜0.001）。血清中VEGF界值為106 pg/mL時，靈敏度84.30%，特異度71.30%。血清中HSP 70界值為12.90 ng/mL時靈敏度82.90%，特異度69.00%。

3 討論

VEGF又被稱作血管通透因子，是最近研究［6-7］最多的細胞因子之一，在組織缺氧時可誘導(dǎo)其大量生成，調(diào)節(jié)血管新生，增加血管的通透性，改善組織的缺血缺氧狀態(tài)，防止血管再狹窄和抑制內(nèi)皮細胞凋亡及保護神經(jīng)細胞的功能。本研究結(jié)果顯示：窒息患兒臍血VEGF水平較對照組顯著增高，其中重度窒息組高于輕度窒息組，與相關(guān)文獻報道［8-9］相似。這些均提示新生兒窒息中VEGF的升高對臨床診斷有重要的意義。缺氧可導(dǎo)致窒息的發(fā)生，新生兒窒息后可導(dǎo)致多臟器缺氧缺血，因此，身體機能發(fā)生改變以保證腦、心、肺等全身臟器的血流供應(yīng)及能量充足［10］。研究報道［11-12］，VEGF可參與窒息患兒體內(nèi)的血液重新分配，在促使新血管形成的同時，發(fā)揮劑量依賴性擴張血管作用，以改善組織的缺血缺氧狀態(tài)。BERNAUDIN等［13］通過將新生小鼠暴露在8%氧氣3 h后使成為缺氧缺血腦損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)腦組織內(nèi)VEGF顯著增加。前期較多研究集中在窒息新生兒血清中VEGF的表達變化，對于VEGF與NBNA評分及窒息嚴重程度的相關(guān)性尚未報道。因此，本課題通過檢測臍血VEGF水平研究其與NBNA評分及窒息嚴重程度的相關(guān)性，有助于評估患兒預(yù)后評估及神經(jīng)修復(fù)。

HSP 70是熱休克蛋白家族中最為豐富且結(jié)構(gòu)最為保守的一類，參與蛋白質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)運等過程，得以穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境。HSP 70在人腦組織內(nèi)含量很少，位于細胞漿內(nèi)，HSP 70 mRNA在高溫、應(yīng)激下反應(yīng)十分敏感；在各種應(yīng)激情況下，其他蛋白質(zhì)的合成明顯減少，而HSP 70的表達量顯著增加，以保護大腦防止來自外界的應(yīng)激刺激，從而對機體產(chǎn)生保護作用［14-15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輕度窒息組與重度窒息組患兒血清中HSP 70表達明顯高于對照組，其中，重度窒息組HSP 70表達水平最高，說明其與窒息及窒息嚴重程度有明顯地相關(guān)性。國內(nèi)外研究表明［16-17］，在腦缺氧的早期HSP 70有著特異性的表達，可保護腦細胞進一步增強腦組織對抗缺氧造成的致死性損傷作用，其不僅有利于神經(jīng)細胞損傷后的修復(fù)，也可作為一種腦缺氧的敏感指標，但HSP 70與NBNA及窒息嚴重程度相關(guān)性目前尚無定論。因此，本實驗通過研究HSP 70與NBNA及窒息嚴重程度相關(guān)性，有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)生診斷新生兒窒息。

本研究對輕度窒息及重度窒息組患兒及對照組新生兒進行了NBNA評分。該評分可反映患兒大腦皮層受損的情況，早期發(fā)現(xiàn)新生兒腦功能異常及預(yù)測腦損傷預(yù)后，具有重要的臨床意義［18］。本研究結(jié)果顯示：窒息是影響NBNA評分的一個重要因素，而且窒息程度與NBNA評分存在關(guān)系，不同日齡新生兒進行NBNA評分，窒息程度越重，評分越低。NBNA評分被廣泛用于臨床評估新生兒窒息所引起的神經(jīng)行為異常，對于早期篩查神經(jīng)行為異常患兒的敏感性強。應(yīng)用NBNA對窒息新生兒進行定期監(jiān)測，使腦損傷患兒得以被早發(fā)現(xiàn)、早診斷，從而有針對性的進行早期干預(yù)，對促進神經(jīng)系統(tǒng)功能康復(fù)起著極其重要的作用［19］。本研究相關(guān)性分析顯示，新生兒血清中VEGF、HSP 70表達水平與NBNA評分呈負相關(guān)，VEGF、HSP 70表達水平越高，NBNA評分越低。

綜上所述，檢測臍血中VEGF、HSP 70表達水平可作為臨床輔助新生兒窒息診斷的客觀生化指標之一，NBNA評分可早期在一定程度上反應(yīng)新生兒窒息的嚴重性，但其具體的臨床價值及其對窒息患兒遠期預(yù)后的評估仍待進一步證實。

參考文獻

［1］陳自勵，劉敬.“新生兒窒息診斷與分度標準建議”解讀［J］.中國當代兒科雜志，2013，15（1）：2-4.

［2］GAGNON M H，WINTERARK P.Effect of persistent pulmonary hypertension on brain oxygenation in asphyxiated term newborns treated with hypothermia［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2016，29（13）：2049-2055.

［3］SWEETAN D U，ONWUNEME C，WATSON W R，et al.Perinatal asphyxia and erythropoietin and VEGF：serial serum and cerebrospinal fluid responses［J］.Neonatology，2017，111（3）：253-259.

［4］中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)會新生兒復(fù)蘇組.新生兒窒息診斷的專家共識［J］.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，19（1）：3-6.

［5］鮑秀蘭.新生兒行為和0-3歲教育［M］.北京：中國少年兒童出版社，1995：120.

［6］BOSKABADI H，OMIDIAN M，TAVALLAI S，et al.Serum Hsp70 antigen：early diagnosis marker in perinatal asphyxia［J］.Iran J Pediatr，2015，25（2）：e381.

［7］CHENG C Y，HO T Y，HSIANG C Y，et al.Angelica sinensis exerts angiogenic and anti-apoptotic effects against cerebral ischemia-reperfusion injury by activating p38MAPK/HIF-1/VEGF-A signaling in rats［J］.Am J Chin Med，2017，45（2），1-26.

［8］WANG Q，GAO S，LUO Y.Compound anisodine affects the proliferation and calcium overload of hypoxia-induced rat retinal progenitor cells and brain neural stem cells via the p-ERK1/2/HIF-1α/VEGF pathway［J］.Exp Ther Med，2017，14（1）：600-608.

［9］SHI X，DOYCHEVA D M，XU L，et al.Sestrin2 induced by hypoxia inducible factor1 alpha protects the blood-brain barrier via inhibiting VEGF after severe hypoxic-ischemic injury in neonatal rats［J］.Neurobiol Dis，2016，95：111-121.

［10］CHEN Y，ZHU H B，LIAO J，et al.Regulation of naotai recipe on the expression of HIF-lα/VEGF signaling pathway in cerebral ischemia/reperfusion rats［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2014，34（10）：1225-1230.

［11］LIANG C，GUO S.Effects of all？trans retinoic acid on VEGF and HIF-1α expression in glioma cells under normoxia and hypoxia and its anti-angiogenic effect in an intracerebral glioma model［J］.Mol Med Rep，2014，10（5）：2713-2719.

［12］OKAZAKI K，KUSAKA T，KONDO M，et al.Temporal alteration of serum G-CSF and VEGF levels in perinatal asphyxia treated with head cooling［J］.Cytokine，2012，60（3）：812-814.

［13］BERNAUDIN M，TANG Y，REILLY M，et al.Brain genomic response following hypoxia and re-oxygenation in the neonatal rat.Identification of genes that might contribute to hypoxia-induced ischemic tolerance［J］.J Biol Chem，2002，277：39728-39738.

［14］GOTOHDA T，KUBO S，KITAMURA O，et al.HSP70 and c-Fos expression of brain stem hypoglossal nucleus in drowning［J］.J Med Invest，2000，47（1-2）：76-79.

［15］CHIO C C，LIN H J，TIAN Y F，et al.Exercise attenuates neurological deficits by stimulating a critical HSP 70/NF-κB/IL-6/synapsin I axis in traumatic brain injury rats［J］.J Neuroinflammation ，2017，14（1）：90.

［16］FARAHMAND S K，GANG L Z，SAGHEBI S A，et al.The effects of wet cupping on serum high-sensitivity C-reactive protein and heat shock protein 27 antibody titers in patients with metabolic syndrome［J］.Complement Ther Med，2014，22（5）：640-644.

［17］KIM J Y.The immune modulating properties of the heat shock proteins after brain injury［J］.Anat Cell Biol，2013，46（1）：1-7.

［18］董榮芝，孟令丹，馬良，等.早產(chǎn)兒血清NSE水平、NBNA評分及其與分娩胎齡、出生體重的相關(guān)性分析［J］.中國婦幼保健，2014，29（12）：1852-1854.

［19］YU X D，ZHANG J，YAN C H.Prenatal exposure to manganese at environment relevant level and neonatal neurobehavioral development［J］.Environ Res，2014，133：232-238.