LASP-1對不同來源成骨細胞的運動、成骨功能及細胞周期分布的影響

賈芳 賴春花 周震 高巖 郭澤鴻 徐淑蘭

南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（廣州510082）

口腔種植體植入后，成骨細胞遷移并吸附至種植體表面的時效性可極大程度地影響種植體負重的時間，影響治療進度［1-5］。影響細胞支架的LASP-1（LIM and SH3 protein）被多數(shù)研究證明可促進腫瘤細胞遷移［6-9］。NISHIKAWA等［10］認為LASP-1在膀胱癌中高表達，可促進腫瘤細胞運動。MG-63作為研究成骨細胞生物學行為的良好細胞模型，在各項研究中被廣泛使用，但其作為腫瘤來源細胞，我們推測其可能與非腫瘤來源細胞在某些生物學功能方面具有差異。因此，本研究擬比較并干擾小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSC）、人成骨細胞（hOB）以及人骨肉瘤細胞（MG-63）中LASP-1的表達，初步驗證其在非腫瘤來源細胞（BMMSC及hOB）和腫瘤來源細胞（MG-63）的表達差異，比較其對該兩大類細胞的運動遷移性能、成骨性能、增殖能力及細胞周期分布比例的影響，以推測LASP-1是否通過影響細胞遷移導(dǎo)致以上各性能差異。為今后研究LASP-1對在非腫瘤來源細胞的其他功能提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

1.1.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）的分離及培養(yǎng) 采用6%水合氯醛，以濃度為0.5 mL/100 g，對6～8周裸鼠進行麻醉，分別延雙側(cè)股骨長軸行縱向切口，分離表皮、肌層及筋膜層，暴露骨端，分離股骨，采用含抗生素的無血清培養(yǎng)基浸泡。使用手術(shù)刀切去兩端骨骺端，暴露骨髓腔，采用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基沖洗至骨質(zhì)透明，于37℃，5%CO2培養(yǎng)3 d后換液。

1.1.2 實驗細胞 本實驗采用人骨肉瘤細胞（MG-63）及人成骨細胞（hOB）作為實驗細胞，均購于中科院上海細胞庫。MG-63、hOB置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行孵育。

1.2 各細胞中LASP-1 mRNA的表達檢測 （1）將BMMSC的細胞密度調(diào)整為1×105個/mL，移入1 mL至6孔板，加入骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（抗壞血酸60 mg/L，15 mmol/L磷酸甘油，12 nmol/L地塞米松，以及20%FBS的DMEM培養(yǎng)基）誘導(dǎo)分化7 d，再將BMMSC、hOB以及MG-63分別以1×106個/mL移入 10 cm2的培養(yǎng)板中，加入 Trizol（Invitrogen，15596026）進行總RNA提取，纖維素柱（dT）（Thermo，69702）進行mRNA分離，采用隨機引物，Super-ScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，18080093）合成cDNA第一鏈；再采用核酸內(nèi)切酶H（上海君瑞）以及T4DNA ligase（Thermo Fisher，15224017）合成第二鏈cDNA，合成dsDNA使用Light Cycler H 480反應(yīng)系統(tǒng)進行實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real time-PCR）。引物序列為：F：5′-ACGATCGGTACCTAAGT TCGATA-3′，R：3′-TAATACGTCTGACCGAATCAGA-5′，LASP-1的引物、探針的設(shè)計及合成由Invitrogen完成。反應(yīng)體系為：LASP-1上下游引物0.4 μL，cDNA 2.5 μL，DEPC 水 ，引 物 GAPDH 0.4 μL，Buffer（10 ×）4 μL，50 mmol/L dNTP 4 μL，Taq酶0.3 μL，MgCl22 μL，總體系 20 μL，以評價 LASP-1 在BMMSC，MG-63和hOB中的表達，初始變性為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，進行45個循環(huán)擴增；55℃變性，30 s退火；42℃冷卻30 s，延伸72℃ 3 min。LASP-1的定量計算通過3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH：序列：F：5′GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′；R：5′CCACAGGATTCCATACC CAA-3′）為基準進行計算。反應(yīng)結(jié)束后，確認擴增及溶解曲線，進行定量分析。實驗重復(fù)3次。

1.3 Western Blot檢測BMMSC、hOB以及MG-63中LASP-1的表達 分別將上述經(jīng)骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMMSC、MG-63和hOB以1×105個/mL移入6孔板，各加入150 μL RIPA裂解液（Thermo，89901），提取總蛋白后，使用BCA蛋白定量試劑盒（ab102536，Abcam）測量蛋白濃度，按操作說明進行。計算各濃度蛋白標準的平均吸光度，繪制標準曲線。提取的總蛋白，加入2×SDS蛋白上樣緩沖液（1∶1），100℃下煮沸 5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。再通過SDS-PAGE膠制作、電泳、轉(zhuǎn)膜、4℃封閉過夜。將膜取出放入抗小鼠單克隆LASP-1抗體（ab130109，Abcam）（1 μg/mL）中，4 ℃封閉過夜；PBST洗膜，5 min×4次；將膜轉(zhuǎn)入二抗（1∶5 000，山羊抗鼠單克隆抗體A00160，南京金斯瑞）中，37℃反應(yīng)1 h；PBST洗膜，5 min×5次；用化學發(fā)光法顯影。

1.4 shLASP-1的轉(zhuǎn)染 將1.2中獲取的cDNA采用末端轉(zhuǎn)移酶TdT（Invitrogen 16314015）進行修飾，形成黏性末端。反應(yīng)體系為：cDNA 1 pmol/L；5 × Reaction buffer 4 μL；dATP 130 pmol；TdT 1.5 μL，加入ddH2O 至20 μL于37℃反應(yīng)20 min，5 μL 0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng)。將質(zhì)粒載體pLV［shLASP］-EGFP（Vector builder）進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系包括以下試劑：10×LA Buffer（Tris-HCl pH8.5100mmol/L，KCl500nmol/L，MgCl215nmol/L）5 μL，100 × BSA 0.5 μL，pLV［shLASP］-EGFP 2 μL，限制性核酸內(nèi)切酶PvuI 1 μL，NcoI 1 μL（Takara），加入ddH2O，總體系共50 μL，于37℃反應(yīng)3 h。再將已修飾的dsDNA及經(jīng)酶切的質(zhì)粒載體于T4DNA ligase的連接反應(yīng)體系中進行連接反應(yīng)，水浴16℃過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DB3.1感受態(tài)細胞（北京華越洋），體積比均為1∶15。加入LB培養(yǎng)基（不含抗生素），于搖床上培養(yǎng)1 h，加入鏈霉素，將平板倒置，37℃培養(yǎng)24 h，篩選陽性克隆菌群。宿主細胞篩選穩(wěn)定后，收集細菌，采用質(zhì)粒小量提取試劑盒（Invitrogen，K210002）進行質(zhì)粒抽提，再行雙酶切反應(yīng)鑒定DNA重組是否成功，酶切體系包括以下試劑：10 × LA Buffer 2 μL，重組質(zhì)粒DNA 10 μL，限制性核酸內(nèi)切酶（同上），ddH2O 6 μL，總體系共20 μL，于37℃下孵育3 h；同時采用瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測酶切結(jié)果；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，當其密度為6×106個/mL，達到70%融合時，進行轉(zhuǎn)染12 h，更換為常規(guī)培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2中培養(yǎng)48 h，收集慢病毒顆粒后，于-80℃保存。采用10倍有限稀釋法進行病毒滴度檢測。確定后，采用MOI=65感染BMMSC，hOB和MG-63（均達到30%匯合度）各12 h后，更換病毒液為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h；附以陰性LASP-1 negative control（LASP-1 NC）及陽性對照組（shMOCK）。采用qRT-PCR進行轉(zhuǎn)染效率的檢測，剩余轉(zhuǎn)染細胞儲存于1 μg/mL的嘌呤霉素中（Thermo Fisher）。見圖1。

圖1 pLV［shLASP］-EGFP質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of pLV［shLASP］-EGFP plasmid DNA

1.5 細胞劃痕實驗 于細胞6孔培養(yǎng)板背面標記穿過培養(yǎng)孔圓心的水平直線，將已轉(zhuǎn)染shLASP-1的BMMSC、hOB以及MG-63細胞以2.2×104個/mL的密度加入6孔板中100 μL，形成單細胞層，采用200 μL槍頭于培養(yǎng)孔內(nèi)垂直于標記線劃痕，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，觀察細胞運動遷移狀態(tài)。

1.6 Western Blot檢測LASP-1對OCN表達的影響 采用成功轉(zhuǎn)染shLASP-1的BMMSC和MG-63，以1×105個/mL接種，兩種細胞均采用RIPA裂解液（Thermo，89901）及BCA蛋白定量試劑盒（Thermo，23235），提取細胞總蛋白并進行定量檢測。常規(guī)進行SDS-PAGE凝膠電泳，具體方法如1.3，加入抗小鼠單克隆OCN抗體（ab13420），封閉洗膜后轉(zhuǎn)入二抗（1∶5 000，山羊抗鼠單克隆抗體A00160，南京金斯瑞）中，37℃反應(yīng)1.5 h；洗膜并過夜進行免疫反應(yīng)，顯影。

1.7 XTT法檢測LASP-1對細胞增殖性能的影響 按1.4將經(jīng)過轉(zhuǎn)染shLASP-1的BMMSCs，hOB以及MG-63細胞密度固定為2.2×104個/mL，于96孔板中分別加入100 μL細胞懸液，于5%CO2，37℃培養(yǎng)3 d，于倒置顯微鏡下觀察，每48 h換液1次，設(shè)置空白對照組、陰性對照組、處理組以及調(diào)零組，每個處理組設(shè)置3個復(fù)孔，加入新鮮配制的XTT與電子偶聯(lián)劑的混合液（50∶1），50 μL/孔，培養(yǎng)4 h，置入酶標儀450 nm處檢測吸光值。見表1。

表1 XTT實驗96孔板各組分布情況Tab.1 Distribution of each group in 96-well plate in XTT experiment

1.8 LASP-1對細胞周期的影響 采用200 μg/mL諾考達唑（Sigma）將經(jīng)shLASP-1轉(zhuǎn)染的MG-63和hOB分別處理20 h，使細胞停留在G2/M期。PBS清洗，并采用CycleTest試劑盒（碧云天C1052）檢測實驗細胞所處的細胞周期。400×g離心5 min后，加入250 μL的A溶液（胰蛋白酶緩沖液）至細胞中，室溫下孵育10 min后，加入200 μL溶液B（胰蛋白酶抑制劑和核糖核酸酶），在室溫下孵育10 min。最后，加入200 μL溶液C（碘化丙啶染色液），避光于冰上孵育10 min。采用Accuri C6流式細胞儀分析（Becton Dickinson）檢測DNA含量。用FCS Express 4對細胞周期分布進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析行整體差異比較，兩組之間的比較采用LSD檢驗，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LASP-1在BMMSC、hOB及MG-63中的表達 LASP-1在BMMSC及hOB中的表達未見明顯差異，而MG-63者則高于前兩者（P＜0.05）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒載體獲得三段分子，其大小分別為：1 198、1 897、6 812 bp，與理論值大小一致。表明重組載體構(gòu)建成功。見圖2、3。

2.2 經(jīng)shLASP-1轉(zhuǎn)染的各細胞遷移性能改變由圖4可見，經(jīng)轉(zhuǎn)染shLASP-1，BMMSC及hOB（非腫瘤來源細胞）的細胞遷移距離較MG-63（腫瘤來源細胞）者稍遠，但未見明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；細胞形態(tài)未見明顯差異。

2.3 shLASP-1轉(zhuǎn)染 經(jīng)轉(zhuǎn)染shLASP-1，LASP-1在BMMSC和hOB中的表達未見明顯變化，但MG-63者則可見表達降低；shMOCK組者，LASP-1在MG-63中明顯升高，但在BMMSC和hOB中仍未見明顯變化。圖5。

圖2 qRT-PCR檢測LASP-1在BMMSC、hOB及MG-63中的表達Fig.2 Expression of LASP-1 in BMMSC，hOB and MG-63 by qRT-PCR

圖3 Western Blot檢測LASP-1在BMMSC、hOB及MG-63中的表達Fig.3 LASP-1 expression of BMMSC，hOB and MG-63 by western blot

圖4 經(jīng)shLASP-1轉(zhuǎn)染，BMMSC、hOB以及MG-63培養(yǎng)12 h的細胞遷移狀態(tài)Fig.4 Cell migration of BMMSC，hOB and MG-63 been cultured for 12h after been transfected with shLASP-1

圖5 qRT-PCR檢測BMMSC、hOB及MG-63經(jīng)shLASP-1轉(zhuǎn)染后LASP-1的表達Fig.5 Expression of LASP-1 of BMMSC，hOB and MG-63 been transfected with shLASP-1

2.4 LASP-1對細胞增殖能力的影響 經(jīng)XTT檢測顯示腫瘤來源的MG-63在經(jīng)shLASP-1轉(zhuǎn)染條件下，細胞數(shù)量降低，增殖能力下降；而shMOCK組則顯示細胞增殖能力明顯上升，細胞數(shù)量升高。而隨LASP-1表達量的改變，BMMSC的細胞數(shù)量未見明顯變化。見圖6。

圖6 XTT檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后BMMSC以及MG-63的細胞增殖情況（200×）Fig.6 XTT result of the cell proliferation of BMMSC and MG-63 after transfection（Amplification of 200）

2.5 LASP-1對OCN表達的影響 經(jīng)轉(zhuǎn)染shLASP-1，改變LASP-1的表達，檢測其對BMMSC以及MG-63的OCN（骨鈣素）表達的影響顯示：BMMSC的OCN表達未受影響；而MG-63者則發(fā)生明顯變化：shLASP-1組的OCN表達降低，而shMOCK組表達含量明顯升高。見圖7。

2.6 LASP-1對細胞周期的影響 LASP-1的表達改變對hOB及MG-63的細胞分布周期的影響見圖8：hOB在不同細胞周期的分布比例未見明顯變化，而MG-63者，shLASP-1組，處于G2/M期的細胞比例有所上升，處于G0/G1期的細胞含量下降；shMOCK組則處于G2/M期的細胞比例下降，處于G0/G1期的細胞比例明顯上升。見圖8。

圖7 LASP-1對BMMSC及MG-63的OCN表達的影響Fig.7 OCN expression of BMMSC and MG-63 after been transfected with shLASP-1

圖8 LASP-1對hOB及MG-63細胞周期的影響Fig.8 Affect of LASP-1 on cellcycle of hOB and MG-63

3 討論

骨組織再生修復(fù)過程主要包括：在破骨活動進行的前提下，骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨前體細胞及成骨細胞、在骨誘導(dǎo)因子作用下遷移至骨缺損區(qū)、分泌骨基質(zhì)蛋白，并促進后期的基質(zhì)礦化［12］。因此，骨誘導(dǎo)分化過程中，破骨細胞導(dǎo)致骨吸收，成骨前體細胞遷移至骨缺損區(qū)是成骨細胞最終分化成熟并發(fā)揮作用的重要前提［13］。

LASP-1為肌動蛋白骨架蛋白，Targetscan數(shù)據(jù)庫分析并驗證在乳腺癌細胞中，LASP-1對于腫瘤細胞遷移和侵襲有明顯促進作用［14-16］，并對肌動蛋白纖維束的穩(wěn)定有重要作用［17-18］。有研究采用KEGG（京都基因及基因組百科全書）分析LASP-1可能參與的細胞通路，發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)性很大的通路：粘附通路：KEGG（04510）［10］，表明其與細胞運動具有重大關(guān)聯(lián)性。然而，關(guān)于其對正常組織細胞遷移影響的研究甚少，因此有必要研究其在正常組織中的表達及功能，以進一步完善對其的了解。基于以上背景，本課題組通過對BMMSC，hOB及MG-63中LASP-1的表達變化以及其對以上各細胞運動性能、增殖性能、OCN表達以及細胞周期分布規(guī)律影響的研究，驗證其是否與正常骨組織的分化及功能發(fā)揮過程具有相關(guān)性，并比較其在非腫瘤細胞及腫瘤細胞中的表達區(qū)別。

如圖3所示，LASP-1在未經(jīng)誘導(dǎo)的BMMSC及hOB中的表達明顯較MG-63者低，這可能與BMMSC和hOB為非腫瘤來源，MG-63為腫瘤來源細胞有關(guān)?；蛩絨RT-PCR檢測與蛋白水平WB的檢測結(jié)果一致。分別轉(zhuǎn)染BMMSC、hOB及MG-63后，發(fā)現(xiàn)BMMSC和hOB的LASP-1表達未見明顯改變，且在不同細胞周期的細胞分布比例未見顯著變化；而采用shLASP-1轉(zhuǎn)染后，MG-63的細胞遷移距離較BMMSC及hOB肉眼觀下略低，但未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；在G2/M期的分布比例明顯升高，在G0/G1期的分布降低，表明其處于DNA合成前期的細胞數(shù)量降低，而處于DNA合成后期的細胞數(shù)量上升，細胞增殖分裂數(shù)量降低；但shMOCK組該細胞系在G2/M期的分布降低，G0/G1期的分布比例升高，細胞增殖分裂數(shù)量升高。即LASP-1與BMMSC的傳代、運動及分化無明顯相關(guān)，亦對hOB者亦無明顯影響，但對MG-63的基因表達及細胞分裂有影響，對之遷移能力未見明顯影響。

骨鈣素OCN可維持骨的正常礦化速率，是骨形成的重要生化標志。通過檢測LASP-1上調(diào)及下調(diào)后對OCN表達的影響，可見LASP-1確可調(diào)節(jié)MG-63的成骨相關(guān)蛋白的表達，但對經(jīng)骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMMSC者則無顯著影響。因此，鑒于LASP-1對該實驗中各細胞的運動能力未見顯著差異性影響，推測LASP-1可能參與介導(dǎo)MG-63的其他因素而影響其成骨過程，因此有待進一步證實；而其對正常骨組織的影響則較小。因此，擬通過調(diào)整LASP-1的表達來改變?nèi)顺晒羌毎纳δ?，則不易實現(xiàn)。有必要通過對其他信號通路的進一步研究，以探索LASP-1與非腫瘤來源組織細胞之間的關(guān)聯(lián)，證明其間是否存在相互作用。

LASP-1在腫瘤來源的MG-63細胞中表達較在非腫瘤來源的BMMSC及hOB中的表達高；通過干擾LASP-1在MG-63中的表達，可見LASP-1表達的改變對細胞增殖能力、成骨能力以及細胞周期的分布比例均發(fā)生明顯變化，但對細胞遷移運動未見明顯影響；在BMMSC及hOB中無此變化?？梢?，LASP-1對腫瘤來源的成骨細胞有調(diào)控作用，而對非腫瘤來源細胞則無明顯影響。

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