遠程缺血預處理對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

余奇勁　田文華　楊云朝

[摘要] 目的 探討遠程缺血預處理（RIPC）對兔脊髓缺血再灌注損傷（SCIRI）的保護作用及其機制。 方法 36只日本大耳白兔隨機雙盲均分為假手術組（S組）、缺血再灌注損傷組（IR組）、IR+RIPC組，每組12只動物。S組不阻斷腹主動脈，IR組和IR+RIPC組夾閉腹主動脈30 min建立SCIRI模型，IR+RIPC組于主動脈阻斷前1 h實施RIPC。三組動物在再灌注2 d和5 d行后肢神經(jīng)功能評分后處死并取脊髓組織L3～L5段，評估病理學變化；同時檢測SOD1活性和SOD1 mRNA的表達水平。 結(jié)果 同一時間點，IR組后肢神經(jīng)功能評分和脊髓組織病理切片分級與 S組相比，顯著降低（P < 0.01）；而IR+RIPC組后肢神經(jīng)功能評分和脊髓組織病理切片分級與IR組相比，則明顯改善，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；術后第2天，與S組比較，IR+RIPC組SOD1活性和SOD1 mRNA的表達水平均顯著升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），而IR組則無明顯變化（P > 0.05）；術后第5天，與S組比較，IR組SOD1活性和SOD1 mRNA的表達水平均顯著降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），而IR+RIPC組則無明顯變化（P > 0.05）；與IR組比較，IR+RIPC組SOD1活性和SOD1 mRNA的表達水平均顯著升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；IR組、IR+RIPC組脊髓組織SOD1 mRNA表達變化與SOD1活性的變化呈正相關（R=0.96、0.97，均P < 0.01）。 結(jié)論 RIPC對兔SCIRI有一定的防治作用，其機制與增強脊髓組織缺血性損傷區(qū)域中SOD1的表達有關。

[關鍵詞] 遠程缺血預處理；脊髓；缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶-1

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（c）-0008-05

Protective effect of remote ischemic preconditioning on spinal cord ischemia reperfusion injury and its possible mechanism in a rabbit model

YU Qijing1 TIAN Wenhua2 YANG Yunzhao1

1.Department of Anesthesiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Department of Anesthesiology， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430000， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of remote ischemic preconditioning （RIPC） on spinal cord ischemia reperfusion injury （SCIRI） and its possible mechanism in a rabbit model. Methods Thirty-six rabbits were randomly divided into sham operation group （Sham group）， ischemia reperfusion group （IR group）， IR+ RIPC group， 12 rats in each group. On the 2 sec and 5th day after reperfusion， 6 animals were sacrificed respectively. Animals in Sham group were exposed abdominal aorta （without interruption）， IR group and IR+RIPC group received abdominal aortic clamp 30 min， and established SCIRI model. IR + RIPC group underwent RIPC before aortic clamp 1 h. All animals were evaluated for hindlimb function scores in postoperative 2 days and 5 days， according to the Tarlov standard， and then were sacrificed and the L3 - L5 segment of the spinal cord were detected to observe the pathological changes of spinal cord tissues. Meanwhile， the SOD1 activity and the expression level of SOD1 mRNA were detected. Results On the same timepoint， compared with the Sham group， the neurological function scores and pathological grading of spinal cord tissue in IR group were significantly decreased （P < 0.01）， but compared with the IR group， the neurological function scores and pathological grading of spinal cord tissue in IR+ RIPC group were significantly improved （P < 0.01）. On the second day after operation， compared with the Sham group， the activity of SOD1 and the expression level of SOD1 mRNA in the IR+RIPC group were all significantly increased （P < 0.01）， whereas there was no significant change in the IR group （P > 0.05）. On the 5th day after operation， compared with the Sham group， the activity of SOD1 and the expression level of SOD1 mRNA in the IR group were all significantly decreased （P < 0.01）， and there was no significant change in the IR+RIPC group （P > 0.05）. Compared with IR group， the SOD1 activity and the expression level of SOD1 mRNA were all significantly increased in the RIPC group （P < 0.01）. The change of SOD1 mRNA expression in spinal cord was positively related to the change of SOD1 activity in IR group or IR+ RIPC group （R=0. 96 or 0.97， all P < 0.01）. Conclusion RIPC has a certain preventive effect on rabbit SCIRI， and its mechanism is related to enhancing the expression of SOD1 in ischemic region of spinal cord tissues.

[Key words] Remote ischemic preconditioning； Spinal cord； Ischemia reperfusion injury； Superoxide Dismutase-1

缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）已經(jīng)被大量的實驗或臨床研究證實：對多種組織器官的缺血性損傷具有保護效果[1-3]。我們早期研究發(fā)現(xiàn)，阻斷腹主動脈實施多次IPC對脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemic reperfusion injury，SCIRI）具有顯著的保護作用[4]。然而，腹主動脈多次被阻斷在臨床應用不切實際，而且反復鉗夾主動脈存在血管損傷的風險。目前已成共識，IPC的保護作用不僅局限于直接缺血的組織，而且還在遠端組織呈現(xiàn)，這種現(xiàn)象被定義為遠程缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）作用[2-3]。目前，RIPC用于防治SCIRI的研究鮮有報道，本項目以動物模型探討RIPC防治SCIRI效果及其機制。

1 對象與方法

1.1 實驗過程

日本大耳白兔 36只[武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室提供，動物批號：SCXK2015-003，動物合格證號：No.00010387]，雄性，3～4月齡，普通級，體量2.2～2.5 kg，普通環(huán)境飼養(yǎng)，健康狀況良好。經(jīng)耳緣靜脈輸注平衡鹽液8 mL/（kg·h）。靜脈麻醉推注3%戊巴比妥鈉1.0 mL/kg（由中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司提供，批號：F20020915，用生理鹽水配備為3%濃度備用），保留呼吸，經(jīng)口氣管插管，靜脈注射肌肉松弛劑維庫溴銨1.0 mg/kg（海南斯達制藥有限公司生產(chǎn)，批號：1212022），接動物呼吸機，控制呼吸，頻率30次/min，吸呼比為1︰2。間斷注射3%戊巴比妥鈉（0.5 mL/kg）和維庫溴銨（0.5 mL/kg）維持麻醉。肝素化后，監(jiān)測腹主動脈阻斷近心端和遠心端的血壓和心電圖，物理保溫保持直腸溫度38℃。所有動物實驗前后肢運動功能均正常。術畢動物清醒，拔除氣管導管，肌內(nèi)注射青霉素40萬U，歸籠飼養(yǎng)。本實驗獲武漢大學人民醫(yī)院動物研究機構(gòu)審查委員會批準，按實驗室動物維護、使用的指導建議和要求處理動物。

1.2 分組方法

36只動物采取隨機數(shù)字表法雙盲均分為假手術組（S組，n=12）、缺血再灌注損傷組（IR組，n=12）、IR+RIPC組（n=12）。在再灌注2 d和5 d時，每組各處死6只動物。S組僅手術分離腹主動脈；IR組和IR+RIPC組參照我們既往方式制造SCIRI[4]，即：于右側(cè)股動脈近心端用動脈壓迫止血器阻斷股動脈血流，持續(xù)5 min；然后恢復股動脈血流5 min。重復以上操作（缺血5 min再灌注5 min）4次，累計40 min；IR + RIPC組于夾閉主動脈前1 h實施RIPC。

1.3 監(jiān)測指標

1.3.1 后肢神經(jīng)功能評分 再灌注2 d和5 d時由1位對動物分組不知情的研究生采用改良Tarlov脊髓損傷評分標準[4]，對所有動物進行后肢神經(jīng)功能評分。

1.3.2 脊髓組織病理學檢測 后肢神經(jīng)功能評分結(jié)束即刻處死動物（2個時點每組各 6 只），取部分脊髓組織（L4～L5段），制作HE染色切片72張（每個標本2張），由對動物分組不知情的同一位病理醫(yī)師在光鏡下（400×）按Naslund等[5]的分級標準進行分級。

1.3.3 脊髓組織SOD1活性檢測 取脊髓組織（L3～L4段）100 mg制作組織勻漿，離心取適量上清液，用SOD1 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，CSB-EL022397RB）檢測SOD1活性。

1.3.4 脊髓組織SOD1 mRNA表達水平的測定 取脊髓組織（L3～L4段）采用實時熒光定量法（RT-PCR）測定SOD1 mRNA與β-actin的相對表達量。蛋白的引物核苷酸由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成（表1）。RT-PCR操作步驟：①提取樣本總RNA，制成RNA溶液。取100 mg脊髓組織置入滲有1 mL的Trizol Reagent勻漿器中充分研磨，加入250 μL三氯甲烷充分混勻，靜置3 min；4℃于1300 g離心8 min，取上清液于新的離心管中并加入0.8倍體積的異丙醇混勻，-20℃放置15 min，4℃于1300 g離心10 min，管底白色沉淀即為RNA；再通過洗滌、離心，加無RNA酶的水溶解RNA。②反轉(zhuǎn)錄。取2 μg RNA溶液置于PCR管中，加入1 μL oligo（dT）15，再加入無核糖核酸酶的去離子水至12 μL，放入PCR儀上70℃保溫5 min，在迅速于冰上冷卻；依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻；然后再放入PCR儀上42℃保溫30 min，后于80℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。③定量PCR。先取0.2 mL PCR管，配制反應體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管；依次加2×qPCR Mix 12.5 μL、2.5 μmol/L基因引物2.0 μL（或2.5 μmol/L內(nèi)標引物2.0 μL）、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL、ddH2O 8.5 μL；再行PCR擴增，預變性95℃ 1 min后，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，循環(huán)40次；末段延伸72℃，5 min，溶解曲線每20 s升溫1℃，由72℃升至95℃。④計算基因的表達量。根據(jù)ΔCT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴增倍數(shù)=2-△△CT計算目的基因與β-actin相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或非參數(shù)秩和檢驗；兩變量間關系分析采用線性回歸分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 再灌注2 d和5 d時各組動物后肢神經(jīng)功能評分比較

再灌注2 d和5 d時，IR組后肢神經(jīng)功能評分與S組相比顯著降低（χ22d = 123.2，χ25d = 128.7，均P < 0.01）；IR + RIPC組與IR組相比則顯著改善（χ22d = 117.2，χ25d= 128.7，均P < 0.01）；IR + RIPC組與S組相比差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 三組動物脊髓組織病理學變化比較

S組再灌注2 d和5 d時脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常（圖1A、B）。IR組再灌注2 d神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴重破壞，胞核幾乎全部溶解、膠質(zhì)顆粒顯著增多（圖1C）；5 d時神經(jīng)元胞核完全溶解（圖1D）。IR + RIPC組再灌注2 d少數(shù)脊髓神經(jīng)元輕微病變，尼氏體基本清晰，偶爾可見空泡（圖1E）；IR + RIPC組再灌注5 d脊髓神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)幾乎接近正?；蛲耆＃▓D1F）。

與S組比較，IR+ RIPC組再灌注2 d和5 d病理切片Naslun d分級結(jié)果均無明顯變化（P > 0.05），而IR組再灌注2 d和5 d差異均有高度統(tǒng)計學意義（χ22d = 263.5，χ25d= 298.2，均P < 0.01）；與IR組比較，IR+ RIPC組再灌注2 d和5 d則均顯著改善（χ22d= 272.6， χ25d= 298.2，均P < 0.01）。見表3。

2.3 三組脊髓組織SOD1活性和SOD1 mRNA檢測結(jié)果比較

再灌注2 d，與S組比較，IR+ RIPC組SOD1活性顯著增強（t=12.288，P < 0.01），且SOD1 mRNA的表達水平顯著升高（t=15.169，P < 0.01），而IR組二者有升高趨勢而差異均無統(tǒng)計學意義（P >0.05）；再灌注5 d，與S組比較，IR組SOD1活性顯著降低（t=26.202， P < 0.01），且SOD1 mRNA的表達顯著減弱（t=26.886， P < 0.01），而IR+ RIPC組二者均無明顯變化（P >0.05）；與IR組比較，IR+ RIPC組SOD1活性顯著增強（t=37.220，P < 0.01），且SOD1 mRNA的表達顯著升高（t=26.373，P < 0.01）。見表4。

2.4 相關性分析

IR組、RIPC組中，SOD1 mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量均呈正相關（R =0.96、0.97，均P < 0.01）。

3 討論

胸腹主動脈瘤、主動脈縮窄、脊柱和骨盆腫瘤等外科手術期間，為創(chuàng)造有利的手術視野和控制術中出血，常需阻斷主動脈血流，然而主動脈血流阻斷超過一定時限即可并發(fā)SCIRI[6-8]。針對如何有效地避免圍術期SCIRI的發(fā)生，國內(nèi)外相關醫(yī)務或科研人員已經(jīng)開展了大量的研究工作[9]。然而，主動脈阻斷手術期間仍有較高的SCIRI發(fā)病率[10]。研發(fā)新的有效且實用的SCIRI防治手段，無疑具有重要臨床意義。本研究結(jié)果顯示：IR + RIPC組實驗動物的后肢神經(jīng)功能評分明顯增高，脊髓損傷病理學改變明顯減輕，甚至逆轉(zhuǎn)正常。這些事實說明RIPC對日本大耳白兔SCIRI具有顯著的防治作用，對RIPC臨床轉(zhuǎn)化應用具有啟示作用。

本研究還進行了RIPC防治日本大耳白兔SCIRI的機制探討。在SCIRI期間，受損脊髓組織發(fā)生顯著的脂質(zhì)過氧化反應，從而活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）不可避免地大量出現(xiàn)。適量的ROS對機體正常的新陳代謝有利，然而超量的ROS卻對機體極為不利。超過機體承受量的ROS可以引發(fā)急劇的氧化應激反應、脂質(zhì)過氧化反應，破壞正常DNA，導致受損區(qū)域組織細胞功能障礙，出現(xiàn)凋亡或壞死[11-12]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）特異性的催化組織中ROS而產(chǎn)生歧化反應，將ROS轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的氧化物或氧氣。在腦和脊髓組織中，SOD主要以SOD1和SOD2兩種形式存在，其中SOD1約占總SOD含量的85%，其是清除ROS的主力軍[13]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[14]：若能夠增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SOD1活性，則神經(jīng)元發(fā)生過度氧化應激反應可被阻止，最終達到防治神經(jīng)元受損的作用。

依據(jù)以上研究結(jié)果推測：中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的損害與組織中SOD1活性的調(diào)節(jié)密切相關，通過調(diào)控脊髓組織中SOD1的表達可以防治SCIRI。外源性SOD1細胞膜滲透性和選擇性極差，因此，其不能直接通過血腦屏障。外源性SOD1只有被轉(zhuǎn)化為載體結(jié)構(gòu)，借助載體形式而透過血腦屏障。目前研究最多的載體肽為PEP-1，其可以與SOD1結(jié)合而成PEP-1-SOD1融合蛋白。PEP-1-SOD1可直接通過血腦屏障而發(fā)揮神經(jīng)保護效應[15]。Eum等[16]研究證實：PEP-1-SOD1腹腔給藥能一定程度地防治沙鼠腦短暫缺血所致的海馬神經(jīng)元凋亡。運用PEP-1-SOD1有效治療物理創(chuàng)傷性脊髓損傷也有報道[17]。同時，Kim等[18]研究也證實，腹腔注射一定劑量的PEP-1-SOD1對SCIRI具有顯著的防治作用。然而PEP-1-SOD1需要復雜的生物工程方法合成，同時國內(nèi)學者合成PEP-1- SOD1的技術已經(jīng)申請國家專利[19]，借助他們的幫助或者購買制備好的PEP-1-SOD1，程序復雜或者成本頗高。相比之下，本研究結(jié)果提示：RIPC可以有效地調(diào)控兔脊髓組織內(nèi)源性SOD1的表達，從而有效防治SCIRI；同時，下肢RIPC操作不影響脊髓的血供，而且RIPC作用之后的遠端器官或組織即刻恢復了正常血流，無缺血性損傷的風險。這些說明，RIPC這種方式具有進一步深入研究的價值。

本研究結(jié)果表明，RIPC通過增強脊髓缺血損害區(qū)域SOD1 的表達而提升脊髓組織對抗缺血傷害能力。在既往動物實驗中[20]，學者發(fā)現(xiàn)缺血前和缺血后Propofol聯(lián)合運用可有效防治SCIRI，Propofol干預可通過激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路而影響SCIRI時脊髓組織SOD1的活性。然而，臨床實踐中Propofol只有在較大劑量應用時，才能有效防止機體器官缺血再灌注損傷[21]，同時Propofol在較大劑量應用時伴隨一些嚴重的相關并發(fā)癥。與RIPC相比，運用Propofol 預處理防治圍術期SCIRI存在極大的缺陷；然而在患者下肢實施RIPC，能否激發(fā)脊髓組織產(chǎn)生足夠的內(nèi)源性SOD1而對抗?jié)撛诘腟CIRI，尚需開展臨床多中心的科研合作和大數(shù)據(jù)分析。我們目前的動物實驗結(jié)果無疑為進一步的臨床研究提供了實驗理論依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-26 本文編輯：任 念）