Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖及其轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

肖茹雪，臧 埔*，郜玉鋼*，趙 巖，祝洪艷，何忠梅，楊 鶴，劉雙利，張連學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118）

人參內(nèi)生多粘類芽孢桿菌中含有多種生物活性物質(zhì)，包括固氮酶、植物激素、多糖、水解酶類、抗生素等[1-3]，在生物固氮、促進植物生長、研制新型抗生素、防治植物病害等方面具有重大應(yīng)用價值[4-8]。隨著環(huán)境污染的日趨嚴重和人們對食品及健康安全要求的提高，微生物農(nóng)藥受到越來越多的重視。本研究采用人參內(nèi)生多粘類芽孢桿菌菌株是從人參植株中分離獲得的，該菌株的發(fā)酵液對人參黑斑病菌（Alternaria panax Whetz.）、人參銹腐菌（Cylindrocarpon destructans Zinns.）、人參菌核病菌（Sclerotinia schinseng Wang.）、人參立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn.）、人參根腐病菌（Fusarium solani App.）及人參細菌性軟腐?。‥rwinia carotovora subsp.）等病原菌具有明顯的防病效果[9]，表現(xiàn)了良好的生防前景，因此如何尋找一種低成本、高效快捷的多粘類芽孢桿菌及其制劑工業(yè)化放大培養(yǎng)方式已成為研究的熱點。

人參皂苷為人參主要藥效成分，但其含量較低，特別是稀有人參皂苷，主要是通過微生物產(chǎn)生的，如酶水解C20上的β-（1-6）-糖苷鍵以及C3上β-（1-2）-葡萄糖苷鍵，繼而生成Rd→F2或Rg3→C-K或Rh2→二醇型人參皂苷元[10]。20世紀70年代日本Koda等[11]發(fā)現(xiàn)用土壤菌的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化人參皂苷可得到稀有皂苷C-K；90年代日本Yosioka等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化后，人參皂苷Rb1、Rg1可形成易于人體吸收的苷元；2006年Su Jinhuan等[13]從土壤中分離出菌株Fusarium proliferatum ECU2042，該菌能水解人參皂苷Rg3成為Rh2，轉(zhuǎn)化率為60.3%。Yousef等[14]利用畸雌腐霉菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化二醇類人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd等為F2。2007年，成樂琴等[15]從土壤中篩選到一株新細菌Microbacterium esteraromatium GS514，發(fā)酵產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化Rb1為Rd、Rg3、F2及C-K。佟心等[16]對德式乳桿菌保加利亞亞種研究表明，其轉(zhuǎn)化人參總皂苷時可以得到人參稀有皂苷Rh2。2011年，楊元超等[17]利用串珠鐮孢菌Fuasarium moniliforme轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷Rb1、Rd為C-K。Cu2＋通過與蛋白質(zhì)或其他有機基團結(jié)合，形成了酶、激素等生物大分子，適量濃度的Cu2＋可促進微生物的生長[18]，可見Cu2＋可提高微生物的增殖。2013年本實驗室用多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參，提高了Rd等人參皂苷單體含量，人參皂苷的轉(zhuǎn)化離不開次生代謝途徑的關(guān)鍵酶催化，可見人參皂苷的轉(zhuǎn)化酶活性對皂苷轉(zhuǎn)化起主要作用[19-21]，Cu2＋是多種酶的活性中心，可能提高其轉(zhuǎn)化酶的活性[22]。因此本研究系統(tǒng)開展了Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖及其轉(zhuǎn)化人參皂苷影響的研究，旨在為利用該菌株進行植物病害的生物防治生產(chǎn)無公害人參食品，并提高人參中人參皂苷含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參（Panax ginseng C. A. Mey.），經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院郜玉鋼教授鑒定為4 a生人參，產(chǎn)地為吉林省撫松縣；多粘類芽孢桿菌來自本實驗室，已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC：No.7250。

人參皂苷對照品Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、compound K、20（R）-Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇質(zhì)量分數(shù)均在98%以上，批號分別為201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513，來自吉林大學(xué)天然藥物化學(xué)實驗室；葡萄糖、CuSO4·5H2O 北京化學(xué)工業(yè)集團有限責(zé)任公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克公司；純凈水杭州娃哈哈公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CHA-S型氣浴往返恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；Tecan Infinite?200 Pro型多功能酶標儀 上海迪奧生物科技有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動進樣器、CLASS-VP色譜工作站）、AUY220電子分析天平 日本島津公司；KQ-250DV超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖的影響

無菌條件下，向每個滅菌試管中分別加入5 mL含Cu2＋質(zhì)量濃度分別為0、10、30、50、100、500、1 000、5 000 mg/L的PDB培養(yǎng)基[23]，每個質(zhì)量濃度處理設(shè)3 次重復(fù)，再向每個試管中分別接種0.05 mL活化的OD600nm值為0.5的多粘類芽孢桿菌菌液，置于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h取樣測定OD600nm值。

1.3.2 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

準確稱取過20目人參粉末10.0 g于100 mL玻璃三角瓶中，置于烘箱80 ℃干熱滅菌2 h，冷卻后，無菌條件下，再向玻璃三角瓶中加入滅菌的含Cu2＋質(zhì)量濃度為10～5 000 mg/L的PDB培養(yǎng)基30 mL，再接種OD600nm為0.5的人參內(nèi)生多粘類芽孢桿菌菌液0.03 mL，轉(zhuǎn)速為120 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為7 d，室溫真空干燥，得人參內(nèi)生多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，4 ℃貯存?zhèn)溆?。精確稱取各待測樣品0.5 g于10 mL離心管中，分別加入5.0 mL色譜甲醇溶液，密封，超聲提取45 min，靜置過夜，再超聲45 min，離心，取上清液，用0.45 μm濾膜濾過，備用。色譜條件參照本實驗室建立的同時測定20種人參皂苷含量的方法[24]。

1.4 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度Cu2＋培養(yǎng)條件下多粘類芽孢桿菌的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Paenibacillus polymyxa at different Cu2+ concentrations

由圖1可見，在本實驗設(shè)計范圍內(nèi)，當(dāng)Cu2＋質(zhì)量濃度為10、30、50 mg/L時，與對照組相比多粘類芽孢桿菌增殖的延遲期縮短，對數(shù)期提前；當(dāng)Cu2＋質(zhì)量濃度為30 mg/L時，延遲期縮短12 h左右，對數(shù)期提前24 h左右；適宜質(zhì)量濃度的Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖有一定的促進作用，其中Cu2＋質(zhì)量濃度為30 mg/L時，對多粘類芽孢桿菌促進作用最強。但當(dāng)Cu2＋質(zhì)量濃度大于100 mg/L時，對多粘類芽孢桿菌增殖有一定的抑制作用，隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強。

2.2 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

2.2.1 色譜峰歸屬

圖2 混標及樣品高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC profiles of mixed reference solution and samples

對照品與樣品色譜圖見圖2。20種人參皂苷單體均得到良好分離。

2.2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

表1 人參皂苷單體回歸方程Table 1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

以進樣中人參皂苷質(zhì)量（Y）對峰面積積分值（X）作圖，得到線性回歸方程，見表1。20 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇在0.5～40 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999，n=6）。

2.2.3 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷含量的影響

如表2所示，轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為10 mg/L時，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3、Rd、原人參三醇、Compound K、原人參二醇同對照組相比含量顯著增加（P＜0.05）；轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋離子質(zhì)量濃度為30 mg/L時，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中15 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇含量均顯著增加（P＜0.05）；轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為50 mg/L時，人參皂苷Rg1、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、原人參三醇、Compound K、Rh2含量顯著高于對照組（P＜0.05）。但是，轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度100 mg/L時，Rg1、Rb1、Rb2及20 種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度500 mg/L時，Rg1、Rf、Rb2及20種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為2 500 mg/L時，Rg1、Rf、Rb1、Rg2、Rb2、Compound K及20 種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度5 000 mg/L時，Rg1、Re、Rf 、Rb1、Rg2、Rb2、Rh4、Rg3及20種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）。綜上可見，轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為10～50 mg/L時，促進多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷，轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為30 mg/L時，多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷能力最強；但轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度超過100 mg/L，Cu2＋反而抑制多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷，并且隨Cu2＋質(zhì)量濃度增大而抑制作用增強。

3 討 論

多粘類芽孢桿菌作為美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的可用于食品的益生菌，也是我國免于安檢的菌株，該菌表現(xiàn)了良好的生防前景，對于降低食品原料的農(nóng)藥殘留有重要意義，因此其應(yīng)用及開發(fā)逐年增多[25-27]。如何高效培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌已成為研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)Cu2＋質(zhì)量濃度為10、30、50 mg/L時，可以相對縮短其延遲期，促進菌體對數(shù)期繁殖速度并提高其增殖數(shù)量，Cu2＋質(zhì)量濃度為30 mg/L時，效果最好；但Cu2＋質(zhì)量濃度超過100 mg/L時，對菌株增殖有明顯的抑制作用。本研究證明適宜質(zhì)量濃度的Cu2＋有利于多粘類芽孢桿菌增殖，對用該菌株進行植物病害的生物防治，從而生產(chǎn)無公害人參食品有一定的參考價值。在多粘類芽孢桿菌實際生產(chǎn)中要考慮微量元素適宜質(zhì)量濃度范圍，研究表明微量元素對菌株的增殖有顯著影響，與其他文獻報道的結(jié)果相一致[28-31]。

本實驗室已證明多粘類芽孢桿菌可顯著提高人參皂苷含量[18-20]，但鮮見用 Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的方法報道，也鮮見Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷適宜質(zhì)量濃度的報道。本研究證明Cu2＋質(zhì)量濃度為10～50 mg/L時，可促進多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷，轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度為30 mg/L時，多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷能力最強，總皂苷加和值為對照組1.64 倍，為微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷或提高其產(chǎn)量提供了理論參考。但轉(zhuǎn)化體系中Cu2＋質(zhì)量濃度超過100 mg/L，Cu2＋反而抑制多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參皂苷，并且隨Cu2＋質(zhì)量濃度增大而抑制作用增強。分析認為這是由于適宜質(zhì)量濃度的Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌對脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進其增殖[32]，而過高質(zhì)量濃度的Cu2＋，反而與巰基結(jié)合，破壞細胞合成酶的活性使細胞喪失分裂增殖的能力[33]；適宜質(zhì)量濃度的Cu2＋提高了多粘類芽孢桿菌的數(shù)量及糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而促進了多粘類芽孢桿菌對人參皂苷轉(zhuǎn)化，其作用機制有待于進一步研究[34]。

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