基于16S rRNA高通量測(cè)序方法比較新疆冷水魚腸道中微生物多樣性

黃麗麗，張 艷，周 紅，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

脊椎動(dòng)物的腸道內(nèi)寄居著大量微生物，形成了復(fù)雜的微生物區(qū)系，這是動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果[1]。而魚類是世界上最古老的脊椎動(dòng)物，胃腸道上皮黏膜附著各種復(fù)雜的微生物[2-3]，對(duì)魚類的消化吸收、生產(chǎn)性能和免疫系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用[4-5]。剛孵化魚的胃腸道通常是無菌的[6]，但從魚卵中孵化后的仔魚慢慢開始捕食和飲水[6-7]，由此食物、水以及水底淤泥等生存環(huán)境中的微生物就得以進(jìn)入魚類的消化道[6,8-9]，成為魚類消化道微生物區(qū)系的最初來源。然而，魚腸道內(nèi)的環(huán)境卻又不同于魚類棲息的環(huán)境，只有能適應(yīng)魚腸道環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)的一些微生物才能夠定植于魚腸道內(nèi)[10]。在魚類生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，魚腸道逐漸形成了一個(gè)由好氧菌、厭氧菌組成的動(dòng)態(tài)菌群，是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[11-12]。研究證明仔魚的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育，形成了不穩(wěn)定的微生物區(qū)系，相對(duì)而言，成魚的消化系統(tǒng)已發(fā)育成熟，腸道微生物區(qū)系比較穩(wěn)定[13]。正常情況下，魚腸道中的各種微生物生長(zhǎng)良好，有益微生物菌群占主導(dǎo)地位以維持腸道的微生態(tài)平衡。但當(dāng)魚類受到某種刺激（如餌料或環(huán)境變更）時(shí)，這種平衡狀態(tài)將會(huì)受到破壞，通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的暴發(fā)[1,14]，特別是在仔魚時(shí)期。魚類腸道中微生物菌群是由魚類、微生物和環(huán)境彼此相互依賴、相互作用形成的統(tǒng)一整體，所以魚腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成容易受到外界環(huán)境、飲食和種系關(guān)系等眾多因素的影響[9,15-17]。

腸道菌群是宿主不可或缺的一部分[2]，也一直是科學(xué)界研究的熱點(diǎn)。過去幾十年，許多研究用傳統(tǒng)的分離與培養(yǎng)、構(gòu)建克隆文庫、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等方法揭示腸道中微生物的多樣性[18-21]，但是這些方法極可能在很大程度上低估腸道微生物的物種組成并高估其豐度，特別是魚腸道微生物區(qū)系復(fù)雜多樣且需厭氧環(huán)境。隨著科學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展，相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物鑒別和分析方法，高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代的測(cè)序方法，具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度等優(yōu)勢(shì)[17,22-23]，被廣泛應(yīng)用到腸道微生物等研究領(lǐng)域，從而極大地提高了對(duì)樣品中微生物多樣性分析的深度和廣度，加深人們對(duì)腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能的了解。

額爾齊斯河流經(jīng)新疆阿勒泰地區(qū)，是我國唯一一條流入北冰洋的外流河，也是新疆的第二大河流，地處北緯45°以上的中高緯度地區(qū)，屬于中溫帶大陸性氣候，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜。其水量主要靠冰雪融水補(bǔ)給，水溫常年在20 ℃以下，河流中棲居著豐富的冷水性魚類。由于常年低溫，使得河流中冷水魚的腸道形成了獨(dú)特的低溫環(huán)境，為腸道內(nèi)的低溫微生物提供了良好的生存保障，也為有關(guān)冷水魚腸道低溫微生物的研究提供了有利的條件。目前關(guān)于腸道微生物的報(bào)道主要集中在陸生脊椎動(dòng)物的腸道微生物，對(duì)魚腸道微生物菌群的研究較少，尤其是新疆特色的野生冷水魚。本研究以新疆額爾齊斯河流域的3 種野生冷水魚為樣本，通過揭示其腸道微生物組成差異及多樣性，以期為額爾齊斯河冷水魚腸道微生態(tài)相關(guān)研究和冷水魚腸道低溫微生物資源開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品1：哲羅魚（Hucho taimen），編號(hào)ZL；樣品2：細(xì)鱗魚（Qinling lenok），編號(hào)XL；樣品3：黑斑狗魚（Esox reicherti），編號(hào)BG，3 種冷水魚都屬于鮭形目。

DNA提取試劑盒 德國Qiagen公司；相關(guān)生理生化試驗(yàn)試劑均購自天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Fresco21型高速冷凍離型機(jī)、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及前處理

2014年8月從新疆額爾齊斯河流域采集冷水魚樣品，每種魚2～3 條（體質(zhì)量（2.00±0.5）kg，年齡約3 a），標(biāo)記后置于4 ℃車載冰箱內(nèi)冷藏，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的冷水魚樣品立即用70%乙醇溶液漂洗后，在超凈工作臺(tái)上用滅菌的手術(shù)刀進(jìn)行解剖，完整地取出魚腸道。再次用70%乙醇溶液擦拭魚腸道外表面，待乙醇晾干后獲取冷水魚腸道的內(nèi)容物和黏膜液（標(biāo)記為C、M），并置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總DNA提取與檢測(cè)

冷水魚腸道樣品先用滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS（pH 7.4））充分洗滌，洗滌液在4 ℃、2 000 r/min條件下離心5 min，之后取上清液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。收集的沉淀再次用PBS充分洗滌，并移入干凈的離心管中，按照TIANamp Stool DNA Kit試劑盒要求進(jìn)行操作，完成冷水魚腸道樣品中細(xì)菌DNA的提取，分別使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的 DNA，最后將DNA溶液于－20 ℃保存。

1.3.3 16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序

針對(duì)16S rDNA V4區(qū)片段進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，提取的DNA作為模板，以515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物，下游引物引入barcode。PCR擴(kuò)增體系：5Prime Hot Master Mix 10 μL，引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，最后補(bǔ)足ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min[23]。

每個(gè)樣品PCR擴(kuò)增3 份，擴(kuò)增產(chǎn)物物通過瓊脂糖凝膠電泳，TEANgel Midi Purification Kit試劑盒回收，用超微量紫外分光光度計(jì)上精確定量，按物質(zhì)的量比例混合后在Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于測(cè)序的原始序列，利用QIIME軟件進(jìn)行去雜、修剪得到可精確分析的優(yōu)化序列，并與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)，在97%的相似性水平上歸類和確定分類單位（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)量，比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)及組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷水魚腸道中DNA提取與定量

提取3 種冷水魚腸道內(nèi)容物和黏膜的DNA，測(cè)定其質(zhì)量濃度與純度，并觀察OD260nm/OD280nm值（表1），以便用于分析冷水魚腸道的細(xì)菌多樣性。

表1 冷水魚腸道DNA質(zhì)量濃度分析Table 1 DNA concentration from the intestinal tract of six cold-water fishes

2.2 冷水魚腸道中微生物群落組成分析

從6 個(gè)樣品共得到高質(zhì)量質(zhì)控序列58 328 條。在97%的相似水平上進(jìn)行OTU序列分類，總共聚成242 個(gè)OTU。依據(jù)劃分的OTU，比較冷水魚樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性。由圖1可知，不同種類的冷水魚樣品聚集在不同的區(qū)域內(nèi)。哲羅魚和細(xì)鱗魚聚集在圖1的右側(cè)，而黑斑狗魚在左側(cè)部分，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組群，表明黑斑狗魚和哲羅魚、細(xì)鱗魚具有明顯的差異性。而主成分2反映出每種冷水魚樣品的腸道內(nèi)容物和黏膜均呈正相關(guān)，這與聚類結(jié)果一致，表明冷水魚腸道內(nèi)容物和黏膜樣本盡管存在差異，但具有一定的相似性。

從6 個(gè)冷水魚樣品中共鑒定出17 個(gè)細(xì)菌門，分別是酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭菌門（Fusobacteria）、硝化螺菌門（Nitrospira）、浮霉菌門（Planctomycetes）、α-變形菌門（Alphaproteobacteria）、β-變形菌門（Betaproteobacteria）、δ-變形菌門（Deltaproteobacteria）、ε-變形菌門（Epsilonproteobacteria）、丙型變形菌門（Gammaproteobacteria）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、未分類菌群（Others）。如圖2所示，相對(duì)豐度較高且6 個(gè)樣品均有分布的主要屬門類群有厚壁菌門、丙型變形菌門、α-變形菌門和擬桿菌門。不同的冷水魚樣品之間腸道微生物菌群明顯不同，其中哲羅魚腸道內(nèi)容物和黏膜中厚壁菌門是最占優(yōu)勢(shì)的菌群門，占各自樣本序列的比例高達(dá)94.11%和87.34%，而細(xì)鱗魚和黑斑狗魚的腸道內(nèi)容物和黏膜中丙型變形菌門占主要優(yōu)勢(shì)，分別占各自樣品序列的28.79%、24.35%、33.35%和23.92%。β-變形菌門是細(xì)鱗魚中第二大優(yōu)勢(shì)菌群，在黑斑狗魚腸道內(nèi)容物中厚壁菌門的相對(duì)豐度僅次于丙型變形菌門，而黏膜中擬桿菌門所占的比例居第2位，β-變形菌門在細(xì)鱗魚腸道內(nèi)容物和黏膜中的相對(duì)豐度基本相同。對(duì)于同種冷水魚而言，盡管腸道內(nèi)容物和黏膜中微生物群落組成相似，但相對(duì)豐度卻略有差異。

圖1 冷水魚腸道和黏膜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析圖Fig. 1 Principal component analysis of bacterial community composition in intestinal contents and mucosa

圖2 冷水魚腸道細(xì)菌門水平菌群分布Fig. 2 Frequency of phylum in microbial communities from fish samples

圖3 冷水魚腸道細(xì)菌屬水平分布及豐度Fig. 3 Frequency and abundance of genus in microbial communities from fish samples

如圖3所示，6 個(gè)樣品共聚為兩個(gè)大分支，細(xì)鱗魚和黑斑狗魚樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，聚在一個(gè)分支里，哲羅魚獨(dú)自聚為一類。屬水平上哲羅魚腸道內(nèi)容物和黏膜中主要以肉食桿菌屬（Carnobacterium）為主，占各自樣品序列的比例高達(dá)97.26%和97.15%。細(xì)鱗魚和黑斑狗魚樣品中微生物菌群比較復(fù)雜，細(xì)鱗魚腸道內(nèi)容物中嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和嗜酸硫桿菌屬（Acidithiobacillus）所占比例較高，達(dá)到14.70%左右，而黏膜中主要以嗜酸硫桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等細(xì)菌種屬為主，黑斑狗魚樣品中主要以梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、硫球形菌屬（Thalassobius）和嗜甲基菌屬（Methylophilus）為主，嗜酸硫桿菌屬、硫球形菌屬、嗜甲基菌屬等屬在湖泊、污泥和礦坑等環(huán)境中比較常見，這與冷水魚生活的環(huán)境有關(guān)。

2.3 冷水魚腸道微生物組成多樣性差異

通過計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，哲羅魚的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是最小的，這說明細(xì)鱗魚和黑斑狗魚中的物種豐度明顯高于哲羅魚。同種類冷水魚之間進(jìn)行比較分析，哲羅魚和黑斑狗魚腸道內(nèi)容物的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于其黏膜，而細(xì)鱗魚例外（圖4a、b）。哲羅魚樣品的Shannon指數(shù)低于細(xì)鱗魚和黑斑狗魚，而Simpson指數(shù)最高，這表明哲羅魚樣品中群落結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。此外，細(xì)鱗魚腸道內(nèi)容物和黏膜的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)幾乎一致，差異不顯著（圖4c、d），而哲羅魚和黑斑狗魚的腸道內(nèi)容物和黏膜的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)相差較大。

如圖5所示，Heatmap圖可以通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品在各分類水平上群落組成的相似性及差異性，這樣能直觀地比較分析不同樣本中的某些屬或同一屬之間的差異。與圖3結(jié)果相似，不同種類的冷水魚微生物群落組成有所不同。哲羅魚的細(xì)菌多樣性最低，主要有肉食桿菌屬、腸球菌屬、支原體屬和明串珠菌屬等，黑斑狗魚樣品中有梭菌屬、交替假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬和嗜甲基菌屬等，而細(xì)鱗魚中有嗜冷桿菌屬、螺菌屬、不動(dòng)桿菌屬、固氮弧菌屬、假單胞菌屬、叢毛單胞菌屬和脫硫弧菌屬等。支原體屬僅在哲羅魚樣品中檢測(cè)到，是哲羅魚特有的屬，沒有檢測(cè)到叢毛單胞菌屬，而黑斑狗魚和細(xì)鱗魚樣品中都有叢毛單胞菌屬的存在。哲羅魚腸道內(nèi)容物和黏膜中的微生物群落組成也不相同，在哲羅魚腸道內(nèi)容物中沒有檢測(cè)到嗜冷桿菌屬、紅小梨形菌屬、梭菌屬、嗜甲基菌屬。在黑斑狗魚和細(xì)鱗魚中檢測(cè)到相同屬，但每個(gè)屬在腸道內(nèi)容物和黏膜中所占有的比例不同。

圖4 冷水魚樣品中微生物多樣性指數(shù)Fig. 4 Microbial diversity indexes of cold-water fishes

圖5 冷水魚腸道屬水平群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖Fig. 5 Heat map of intestinal bacterial community structure of cold-water fishes at genus level

3 討 論

有研究結(jié)果表明，魚腸道中細(xì)菌的數(shù)量級(jí)為105～108[24]。據(jù)報(bào)道，厚壁菌是大多數(shù)脊椎動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群[17]，而在魚消化道中常見的微生物主要有厚壁菌、變形菌、假單胞菌、不動(dòng)桿菌[25-26]，并且其中一些腸道微生物在魚類的生長(zhǎng)、代謝過程中起著關(guān)鍵作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)同種冷水魚腸道內(nèi)容物和黏膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異并不明顯；但不同種類的冷水魚腸道中微生物群落組成差異顯著，即使在每個(gè)樣品中共同存在的一些微生物，在不同樣品中其豐度也各有所異。相較于細(xì)鱗魚和黑斑狗魚，哲羅魚腸道內(nèi)微生物組成較為簡(jiǎn)單，主要以肉食桿菌和希瓦氏菌為主；細(xì)鱗魚腸道中嗜冷桿菌、嗜酸硫桿菌、叢毛單胞菌和固氮弧菌所占比例較高，而梭菌、硫球形菌屬和嗜甲基菌是黑斑狗魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。Clements等[28]研究發(fā)現(xiàn)在3 種不同的海水魚（Kyphosus sydneyanus、Odax pullus和Aplodactylus arctidens）后腸中以厚壁菌和梭菌為主。梭菌在哺乳動(dòng)物的腸道中比較常見，是兼性厭氧微生物，能酵解多糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生乙醇和短鏈脂肪酸[17]；短鏈脂肪酸是魚腸道中重要的有機(jī)酸，為腸道內(nèi)壁細(xì)胞基本的代謝提供能量來源[29]。本研究從黑斑狗魚腸道樣品中也檢測(cè)到較多的梭菌，而相較于黑斑狗魚，在哲羅魚和細(xì)鱗魚樣品中梭菌則幾乎為零，這可能是由于黑斑狗魚腸道較長(zhǎng)[30]，食物在消化道內(nèi)發(fā)酵比較充分造成的。此外，有研究證明，從魚腸道中分離出來的一些微生物能夠有效地抑制一些病原菌[31]。鄧梅等[32]從冷水魚腸道篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的耐低溫腸球菌Enterococcus sp. MB2-1，其最適生長(zhǎng)溫度在24 ℃左右，能抑制李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及大腸桿菌（Escherichia coli）的生長(zhǎng)。Robertson等[33]從大馬哈魚腸道中分離出肉食桿菌，能抑制米勒鏈球菌（Streptococcus milleri）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和嗜鰓黃桿菌（Flavobacterium branchiophilum）等病原微生物的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)也從冷水魚腸道樣品中檢測(cè)到了肉食桿菌和腸球菌的存在，其在哲羅魚腸道中的豐度最高，占到97%左右，而在細(xì)鱗魚和黑斑狗魚中相對(duì)豐度較低。嗜冷桿菌是細(xì)鱗魚腸道內(nèi)容物中的優(yōu)勢(shì)菌，嗜冷桿菌屬于低溫菌，即使在冷藏環(huán)境下也具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)活性，這對(duì)低溫微生物開發(fā)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

眾所周知，脊椎動(dòng)物腸道內(nèi)的各類微生物與宿主的關(guān)系密切，對(duì)宿主的生長(zhǎng)、發(fā)育和健康等有重要影響[34]。腸道群落結(jié)構(gòu)的失衡可能會(huì)引起宿主發(fā)生疾病，因此，一些科學(xué)家提出腸道微生物相當(dāng)于宿主的一個(gè)額外的“器官”[11,35]。反過來，腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成可能會(huì)受到宿主的基因型、飲食、年齡和棲息環(huán)境等因素的影響[36]。許多有關(guān)脊椎動(dòng)物腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)不同食性（草食性、雜食性和肉食性等）的脊椎動(dòng)物腸道菌群有所不同。Ward等[9]發(fā)現(xiàn)雜食性日本鯽（Carassius cuvieri）的腸道菌群比那些肉食性魚類較為復(fù)雜。Ni Jiajia等[37]利用DGGE技術(shù)對(duì)不同生存環(huán)境草魚（Ctenopharyngodon idellus）的腸道微生物進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，魚類的生活環(huán)境也會(huì)影響其腸道微生物群落。哲羅魚喜歡潛伏在深水或兩岸隱蔽處，常以其他魚類和水中活動(dòng)的蛇、蛙及水鳥為食，但在夏季水溫稍高時(shí)，食欲較差，甚至?xí)型Ｊ超F(xiàn)象出現(xiàn)；細(xì)鱗魚多在水流湍急、大型礫石底的河段活動(dòng)，主要以水生脊椎動(dòng)物為食，也食被風(fēng)吹落的陸生昆蟲，一年四季都活躍攝食；黑斑狗魚喜棲息于水溫較低江河的緩流和水草叢生的沿岸帶，以魚、蝦和水禽的幼鳥為食，在魚餌不足時(shí)甚至?xí)韵鄽埵砙30]。叢毛單胞菌常見于貝類和昆蟲的體表；假單胞菌廣泛存在于土壤、水中，且嚴(yán)格好氧；漫游球菌、肉食桿菌是兼性厭氧菌，且肉食桿菌對(duì)一些致病菌有抑制作用。本研究中只在細(xì)鱗魚樣品中檢測(cè)到豐度較高的叢毛單胞菌，這些菌有可能是通過魚類攝食進(jìn)入魚腸道的；假單胞菌大量存在于細(xì)鱗魚和黑斑狗魚腸道內(nèi)，漫游球菌、肉食桿菌幾乎只在哲羅魚腸道內(nèi)被檢測(cè)到，這可能跟魚類在河流中的垂直分布有關(guān)，哲羅魚多在深水處活動(dòng)，腸道內(nèi)處于微氧狀態(tài)，適合兼性厭氧菌大量生存，而假單胞菌等好氧菌則無法長(zhǎng)期存活。由此推斷本研究中冷水魚腸道微生物群落的組成可能和魚在河流中的分布和攝食類型有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3 種冷水魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與組成及多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)同種魚腸道內(nèi)容物和黏膜之間群落結(jié)構(gòu)組成相似，無顯著差異；不同種魚之間腸道微生物群落構(gòu)成及多樣性存在明顯差異，這可能與攝食種類、環(huán)境、分布、生活習(xí)性等因素有關(guān)。通過本研究，對(duì)額爾齊斯河魚腸道微生物種群結(jié)構(gòu)有了初步了解，也為冷水魚腸道微生態(tài)的進(jìn)一步探究和冷水魚腸道低溫微生物資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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