蓮房原花青素低聚體納米脂質體的制備及其穩(wěn)定性、抗氧化性分析

尹 浩，陳 婭，陶 濤，謝筆鈞，孫智達*

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

蓮房是蓮子加工過程中的副產(chǎn)物，因其富含原花青素，而具有應用價值[1]。蓮房原花青素是繼葡萄籽原花青素后又一重要的原花青素來源。蓮房原花青素低聚體（lotus seedpods oligomeric procyanidins，LSOPC）平均聚合度為3.2，大部分以兒茶素或表兒茶素為結構單元，通過C4—C8或C4—C6鍵連接，其延伸單元也可同沒食子兒茶素相連，為B型原花青素[2-3]。原花青素低聚體具有優(yōu)良的生物活性，如抗氧化[4]、抗輻射[5]、調節(jié)血糖[6]、提高記憶力[7]、抗癌[8]、延緩衰老[9]等。但是原花青素低聚體在體內(nèi)的生物利用率很低，而且相當不穩(wěn)定，極易受到環(huán)境因素的影響，如溫度、光照、pH值、氧化還原劑等[10]。此外，原花青素低聚體的親水性也在很大程度上限制了其在脂質體系中抗氧化活性的發(fā)揮。為了提高其生物利用度和穩(wěn)定性，擴大其在油脂體系中的應用范圍，故而構建LSOPC脂質體運載體系[11-12]。脂質體是一種具有類細胞結構的微型囊泡，由雙親性脂質壁材組成，因為其生物相容性以及可以同時包埋親水性和疏水性物質的特性，成為食品和醫(yī)藥領域研究的熱點[13]。此外，脂質體還具有粒徑小、具有靶向性、制備簡單、吸收性好等特點[14]。在過去的10年間，脂質體在食品領域的應用研究大量增加，包埋的食品相關物質包括酶、維生素、功能肽等[15]。但欲獲得平均粒徑較小，且包埋率大的理想脂質體卻是目前脂質體研究的難題。為此，本實驗采用逆向蒸發(fā)法與超聲波處理相結合，制備LSOPC納米脂質體，并考察LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性和抗氧化性，以提高LSOPC的生物利用率和穩(wěn)定性，并擴大其應用范圍，為其在食品工業(yè)和保健品行業(yè)的利用提供基礎和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房采自武漢市湯遜湖，品種為武植2號；葡萄籽原花青素標準品（純度為95%） 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；AB-8大孔吸附樹脂 南開大學化工廠。

大豆卵磷脂、膽固醇、水溶性VE（Trolox）、偶氮二異丁基脒鹽酸（2,2’-azobis (2-methyl-propanimidamide)dihydrochloride，AAPH）、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 美國Sigma公司；吐溫80、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯仿、碘化鉀、無水乙醇、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、三氯化鐵、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋅、氯化銅、氯化鎂、氯化鋁、醋酸鉛、氯化亞鐵、氯化鐵、葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀（均為分析純試劑） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

H-7650透射電子顯微鏡 日本日立有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分布儀 英國Malvern儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-9100紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；Microfuge 20R臺式微量離心機 日本貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器武漢科爾儀器設備有限公司；分析天平 上海倫捷機電儀表公司；FS-600N超聲波分散儀 上海超析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LSOPC的提取

提取方法參考文獻[16]。新鮮蓮房剪碎后，按料液比1∶10（g/mL）加入體積分數(shù)70%乙醇溶液，55 ℃遮光恒溫浸提2 h，減壓旋蒸回收乙醇，然后將濃縮液過AB-8大孔樹脂，用蒸餾水洗去雜質，再用70%乙醇溶液洗脫，減壓濃縮洗脫液，真空冷凍干燥，得蓮房原花青素提取物粉末。將得到的粉末經(jīng)乙酸乙酯萃取，即可得到LSOPC。

1.3.2 LSOPC納米脂質體的制備

采用逆向蒸發(fā)法制備LSOPC納米脂質體[17-18]。用氯仿溶解一定比例的大豆卵磷脂和膽固醇，在超聲的同時加入用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS；50 mmol/L，pH 7.4）溶解的LSOPC，旋轉蒸發(fā)除去氯仿，然后加入30 mL含有吐溫80的PBS，繼續(xù)旋轉水化20 min。冰浴超聲處理（超聲時間5 min，超聲功率350 W，脈沖5 s/5 s）后得到LSOPC納米脂質體。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 大豆卵磷脂-膽固醇質量比對脂質體平均粒徑的影響

固定LSOPC添加量0.33 mg/mL、吐溫80添加量3.3 mg/mL，選擇大豆卵磷脂-膽固醇質量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，以脂質體的平均粒徑為評價指標，研究大豆卵磷脂-膽固醇質量比對脂質體平均粒徑的影響[14]。

1.3.3.2 LSOPC添加量對脂質體平均粒徑的影響

固定大豆卵磷脂-膽固醇質量比3∶1、吐溫80添加量3.3 mg/mL，選擇LSOPC添加量為1、0.50、0.33、0.25、0.20 mg/mL，以脂質體的平均粒徑為評價指標，研究LSOPC添加量對脂質體平均粒徑的影響[14]。

1.3.3.3 吐溫80添加量對脂質體平均粒徑的影響

固定大豆卵磷脂-膽固醇質量比為3∶1、LSOPC添加量0.33 mg/mL，選擇吐溫80添加量為3.3、6.7、10.0、13.3、16.7、20.0 mg/mL，以脂質體的平均粒徑為評價指標，研究吐溫80添加量對脂質體平均粒徑的影響[17]。

1.3.4 LSOPC納米脂質體制備的正交試驗

為優(yōu)化脂質體的制備條件，以大豆卵磷脂-膽固醇質量比、LSOPC添加量、吐溫80添加量為變量，以脂質體的平均粒徑作為衡量指標，進行3因素3水平的L9（33）正交試驗，各自變量水平的選取根據(jù)單因素試驗結果進行確定，具體見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Coded levels of independent variables used in orthogonal array design

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 粒徑的測定

將待測樣品稀釋適當倍數(shù)，取1 mL裝入聚苯乙烯比色皿中，（25±0.1）℃保溫3 min，進行測定，記錄平均粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）[19]。

1.3.5.2 包埋率、有效載量的計算

游離LSOPC的測定采用有機溶劑萃取法[20]。取適量LSOPC納米脂質體于試管中，加入乙酸乙酯，渦旋混合，5 000 r/min 離心5 min，取上層乙酸乙酯液，重復操作2 次，合并乙酸乙酯液，繼續(xù)用乙酸乙酯定容至10 mL，用可見分光光度計法測定其含量。包埋率、載量和有效載量的計算按公式（1）～（3）進行計算：

1.3.5.3 微觀結構觀察

用超純水稀釋樣品至脂質達到合適的濃度。將稀釋液滴入銅網(wǎng)中，用磷鎢酸染色，用濾紙吸干多余的液體，在室溫下干燥滴有樣品的銅網(wǎng)，待銅網(wǎng)干燥后，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察樣品[21]。

1.3.5.4 弱堿（pH 7.4）條件下的穩(wěn)定性

原花青素在堿性條件中非常不穩(wěn)定[10]，但是為了模擬小腸和體液的pH值環(huán)境，脂質體常選擇pH值為7.4的緩沖液[22]。所以研究LSOPC脂質體在弱堿性環(huán)境（pH 7.4）的穩(wěn)定性非常有必要。用PBS（pH 7.4，50 mmol/L）溶解LSOPC，將LSOPC溶液與LSOPC納米脂質體在37 ℃孵育一定時間，于430 nm波長下測定其吸光度。

1.3.5.5 溫度對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

將LSOPC納米脂質體分裝于具塞試管中，分別置于40、60、80、100 ℃的水浴鍋中，每隔1.0 h取樣，測量平均粒徑[23]。另取LSOPC納米脂質體，分別存放于4 ℃和37 ℃的環(huán)境中進行長期貯藏，隔7 d取樣，測量平均粒徑，并按公式（4）計算平均粒徑變化率：

1.3.5.6 金屬離子對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

配制不同質量濃度的AlCl3、MgCl2、BaCl2、KCl、CaCl2、NaCl、CuCl2、FeCl2、FeCl3、ZnCl2、(CH3COO)2Pb溶液，取1 mL LSOPC納米脂質體，加入等量的金屬離子溶液，混合均勻。在40 ℃的水浴鍋中保溫2 h后測量平均粒徑，以純水作為空白對照[24]。

1.3.5.7 糖和防腐劑對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

配制不同質量分數(shù)的蔗糖、葡萄糖溶液，取1 mL LSOPC納米脂質體，加入等量的糖溶液，混合均勻后在40 ℃的水浴鍋中保溫2 h，測量平均粒徑，以純水作為空白對照[25]。山梨酸鉀和苯甲酸鈉溶液對脂質體穩(wěn)定性的測量方法同糖溶液。

1.3.5.8 ABTS＋·清除率的測定

用純水配制含ABTS（7 mmol/L）與過硫酸鉀（2.45 mmol/L）的混合溶液，置于暗處孵育12～16 h。稀釋基液至其在波長734 nm處吸光度為0.700±0.005。取0.1 mL不同濃度受試物溶液與3.9 mL稀釋液混合，23 ℃孵育6 min，測定樣品在734 nm波長處的吸光度，純水作空白對照[26]。按公式（5）計算ABTS＋·清除率：

式中：A1為加入樣品和ABTS的吸光度；A2為純水空白對照組的吸光度。

1.3.5.9 鐵還原能力的測定

參照文獻[27]方法：取1 mL樣品，加入1 mL鐵氰化鉀（2.5 g/100 mL），在50 ℃水浴中反應20 min?？焖倮鋮s，加入5 mL TCA（10 g/100 mL），充分混勻后過濾。取濾出液2 mL，加入2 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵（0.1 g/100 mL），混合均勻，靜置10 min后在700 nm波長下測定吸光度（A700nm）。用吸光度表征鐵還原能力，吸光度越大，表示還原能力越強。

1.3.5.10 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法對納米脂質體總抗氧化能力的評價

參考相關文獻[28]：熒光素鈉鹽、AAPH、Trolox用75 mmol/L PBS（pH 7.2）溶解并稀釋。在黑色熒光酶標板的微孔中分別加入25 μL不同濃度的樣品溶液，然后向各微孔中加入150 μL濃度為8.61×10－5mmol/L的熒光素鈉鹽溶液，中速振搖2 min，37 ℃孵育10 min后，加入25 μL 153 mmol/L的AAPH溶液并迅速啟動反應，測定熒光強度（激發(fā)波長（485±20）nm，發(fā)射波長（530±20）nm）。整個體系保持37 ℃，每隔2 min測定一次熒光強度，且每次測定前要中速振動孔板10 s。數(shù)據(jù)處理參考相關文獻[29-30]。

1.3.5.11 抗脂質過氧化能力的測定

LSOPC的抗脂質過氧化能力可以通過測定體系中與硫代巴比妥酸反應的底物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）變化率來表征。參考文獻[15]方法：在試管中分別加入1 mL樣品、1 mL 400 μmol/L三氯化鐵和1 mL 400 μmol/L VC，混合均勻。在避光的條件下，37 ℃水浴60 min，然后加入5 mL TCA-TBA-HCl混合液（TCA 37.5 g、TBA 0.925 g、濃HCl 5.25 g溶于超純水，80 ℃水浴并攪拌溶解，冷卻后用超純水定容至250 mL，過濾備用），隨后100 ℃沸水浴10 min，冰浴冷卻，離心后取上清液在535 nm波長處測定吸光度?？瞻坠芤? mL超純水分別代替VC和三氯化鐵溶液，測定吸光度。按公式（6）計算TBARS變化率：

式中：As為加入VC和三氯化鐵后測得的吸光度；Ac為以純水代替VC和三氯化鐵后測得的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 大豆卵磷脂-膽固醇質量比對脂質體平均粒徑的影響

圖1 大豆卵磷脂-膽固醇質量比對脂質體平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of ratio of phosphatidylcholine to cholesterol on the average size of LSOPC nanoliposome

脂質體的膜材主要是由膽固醇和卵磷脂構成的，兩者的比例對脂質體的粒徑影響顯著[17]。由圖1可知，當大豆卵磷脂-膽固醇質量比小于3∶1時，隨著大豆卵磷脂比例的增加，脂質體的平均粒徑變小，當二者質量比大于3∶1時，脂質體平均粒徑變化趨于平穩(wěn)。當兩者質量比為3∶1時，脂質體平均粒徑最小，為（92.05±0.63）nm。故選擇大豆卵磷脂-膽固醇質量比為2∶1、3∶1、4∶1進行正交試驗。PDI可以反映脂質體粒徑的分布情況，脂質體PDI均小于0.3，這說明脂質體內(nèi)部顆粒分散均勻性良好[17]。

2.1.2 LSOPC添加量對脂質體平均粒徑的影響

圖2 LSOPC添加量對脂質體平均粒徑的影響Fig. 2 Effect of LSOPC concentration on the average size of LSOPC nanoliposome

LSOPC添加量會影響脂質體的平均粒徑，LSOPC添加量過多或過少都會導致LSOPC包埋不成功，從而導致脂質體的粒徑發(fā)生變化。由圖2可知，隨著LSOPC添加量的增加，脂質體平均粒徑先減小后增加，當LSOPC添加量為0.33 mg/mL時，脂質體的平均粒徑達到最小，為（87.95±0.62）nm，且此時PDI也最小，為0.17±0.01。因此，選擇LSOPC添加量0.25、0.33、0.5 mg/mL進行正交試驗。

2.1.3 吐溫80添加量對脂質體平均粒徑的影響

圖3 吐溫80添加量對脂質體平均粒徑的影響Fig. 3 Effect of Tween 80 concentration on the average size of LSOPC nanoliposome

由圖3可知，吐溫80添加量對脂質體粒徑有明顯的影響。脂質體的平均粒徑隨著吐溫80的加入逐漸降低，當吐溫80添加量為16.7 mg/mL時，脂質體的平均粒徑達到最小值。這表明高親水親油值的乳化劑有利于親水性的LSOPC緊密結合，從而促進了與其他脂質膜材料的結合而減小了脂質體的粒徑。當繼續(xù)加入吐溫80時，脂質體的平均粒徑基本保持不變，故選擇吐溫80添加量為10、13.3、16.7 mg/mL進行正交試驗。

2.2 正交試驗結果

由表2、3可知，3 個因素對脂質體平均粒徑影響的主次順序為C＞A＞B，即吐溫80添加量＞大豆卵磷脂-膽固醇質量比＞LSOPC添加量。正交試驗的最佳工藝條件為A2B2C3，即大豆卵磷脂-膽固醇質量比3∶1、LSOPC添加量0.33 mg/mL、吐溫80添加量16.7 mg/mL。以此工藝條件制備LSOPC納米脂質體進行驗證實驗，測量的平均粒徑為（35.57±0.08）nm、PDI為0.153±0.01，粒徑分布如圖4所示。在本試驗所取的因素和水平下，吐溫80添加量對脂質體平均粒徑具有顯著影響，是影響脂質體平均粒徑的主要因素。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

圖4 LSOPC納米脂質體粒徑分布圖（n=3）Fig. 4 Particle size of the optimized LSOPC nanoliposome (n = 3)

2.3 LSOPC納米脂質體的包埋能力

圖5 LSOPC納米脂質體在不同載量時包埋率和有效載量Fig. 5 Encapsulation efficiency and effective loading of LSOPC nanoliposome at different initial loading levels

除了粒徑外，衡量脂質體應用價值的重要指標還有包埋率和有效載量。包埋率和有效載量能反映體系中LSOPC的保留率和表觀溶解性[17]。由圖5可知，在所考察的載量范圍（0.25%～2%）內(nèi)，脂質體的包埋率維持在70%左右，在載量為1%時有最高值，達（71.97±0.42）%。而且隨著LSOPC添加量的增加，有效載量呈直線上升，這說明在此載量范圍（0.25%～2%）內(nèi)，LSOPC能夠有效地包埋在脂質雙分子層中。

2.4 LSOPC納米脂質體的微觀結構觀察

圖6 LSOPC納米脂質體電鏡圖Fig. 6 TEM micrographs of LSOPC nanoliposome

由圖6可以看出，LSOPC納米脂質體為球形或近似球形的囊泡結構，粒徑小（10～100 nm），彼此分散且較為均一。

2.5 弱堿（pH 7.4）條件下的穩(wěn)定性

圖7 LSOPC溶液和LSOPC納米脂質體在pH 7.4、溫度37 ℃條件下的穩(wěn)定性Fig. 7 Stability profiles of LSOPC solution and nanoliposome in hydrogen phosphate buffer at pH 7.4 (37 ℃)

由圖7可知，在0 h時，LSOPC溶液和LSOPC納米脂質體的吸光度均較小，分別為0.217±0.01、0.143±0.01。兩者的吸光度都隨著貯存時間的延長而增大，且LSOPC溶液的吸光度明顯高于LSOPC納米脂質體。在0～6 h，兩者的吸光度之差隨著時間的延長而增大，6 h后，兩者吸光度差異維持在3 倍左右。到24 h時，兩者的吸光度分別達到1.458±0.05、0.529±0.05。以上結果可以說明，脂質體能顯著地降低LSOPC的氧化速率，提高LSOPC在弱堿（pH 7.4）條件下的穩(wěn)定性。

2.6 溫度對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，隨著溫度的升高，LSOPC納米脂質體的平均粒徑呈明顯的增大趨勢。當溫度為40 ℃和60 ℃時，脂質體的粒徑無明顯變化。在80 ℃時，脂質體平均粒徑變化較小，而100 ℃時其粒徑則發(fā)生顯著變化。LSOPC納米脂質體在80 ℃和100 ℃水浴放置7 h后平均粒徑分別達到（59.93±1.04）、（486.43±25.35）nm。長期貯藏實驗結果說明，脂質體在低溫環(huán)境里平均粒徑變化率更小，低溫有利于脂質體的長期貯藏。在4 ℃貯藏7 周后，其平均粒徑變化率僅為0.239。

圖8 溫度對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of temperatures on stability of LSOPC nanoliposome

2.7 金屬離子對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

圖9 金屬離子對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響Fig. 9 Effect of metal ions on stability of LSOPC nanoliposome

由圖9可知，在實驗所考察的金屬離子中，F(xiàn)e3＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋的加入對脂質體的粒徑有顯著性影響，脂質體的粒徑隨著金屬離子質量濃度的增加而增大。此外，F(xiàn)e2＋的加入雖對粒徑影響不大，但是會改變脂質體體系的顏色。所以LSOPC納米脂質體在實際應用中要避免與這些金屬離子共存，防止遭到破壞，影響其應用。

2.8 糖對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

由圖10可知，當葡萄糖和蔗糖的質量分數(shù)達到10%時脂質體的粒徑發(fā)生變化，達到20%時脂質體的粒徑顯著增大。這可能是由于糖是一種極性物質，高濃度的糖會降低水的活度，從而導致脂質體的粒徑發(fā)生改變[31]。

圖10 糖對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響Fig. 10 Effect of sugars on stability of LSOPC nanoliposome

2.9 防腐劑對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響

圖11 防腐劑對LSOPC納米脂質體穩(wěn)定性的影響Fig. 11 Effect of preservatives on stability of LSOPC nanoliposome

由圖11可知，在實驗考察的質量濃度范圍內(nèi)，隨著苯甲酸鈉和山梨酸鉀的加入，LSOPC納米脂質體的粒徑幾乎沒有變化，這說明苯甲酸鈉和山梨酸鉀對脂質體的穩(wěn)定性無顯著影響。

2.1 0 LSOPC納米脂質體的抗氧化能力

2.10.1 ABTS＋·清除能力和鐵還原能力

由圖12A可知，制備初期的LSOPC納米脂質體和同質量濃度LSOPC溶液的ABTS＋·清除率IC50值分別為44.68、38.55 μg/mL，脂質體ABTS＋·清除能力要低于LSOPC溶液?？赡艿脑蚴荓SOPC包埋進脂質體后其供電子能力會受到磷脂雙分子層的干擾，導致其清除ABTS＋·能力下降[22]。但是在4 ℃避光環(huán)境中貯藏7 d后，兩者的IC50值分別變?yōu)?9.91、84.94 μg/mL。這說明，盡管包埋之后的LSOPC清除ABTS＋·的能力沒有提高，但是LSOPC的穩(wěn)定性卻顯著的提高了。同樣的，由圖12B可知，在制備初期，相同質量濃度的LSOPC納米脂質體和LSOPC溶液鐵還原力相差不大。但是經(jīng)過在4 ℃貯藏7 d后，LSOPC溶液的鐵還原能力相對于脂質體顯著地降低。

圖12 LSOPC納米脂質體和LSOPC溶液ABTS ·清除能力（A）和鐵還原能力（B）Fig. 12 ABTS scavenging activity (A) and reduction power (B) of LSOPC nanoliposome and LSOPC solution

2.10.2 總抗氧化能力

圖13 Trolox系列濃度標準溶液熒光衰減圖Fig. 13 The attenuation curve of fluorescence intensity of Trolox series standard solution

ORAC法是目前國際上普遍采用的評價總抗氧化能力的方法。選擇ORAC法對LSOPC納米脂質體進行總抗氧化能力評價。Trolox系列標準溶液的熒光衰減圖如13所示，以時間為橫坐標，凈面積為縱坐標，可以得到Trolox系列標準溶液標準曲線方程：y=0.429x＋1.463 6（R2=0.995 3）。圖14為不同質量濃度LSOPC納米脂質體和LSOPC溶液在制備初期和在4 ℃貯藏7 d后的熒光衰減趨勢圖。由圖14可知，兩者都能明顯延緩熒光物質被活性氧自由基猝滅的速度，而且質量濃度越高，熒光衰減的速度越慢，即總抗氧化能力越強。在制備初期，包埋于脂質體中的LSOPC相比于單獨存在的LSOPC溶液有更強的抗氧化活性，其ORAC值分別為24 462.31、17 245.24 μmol TE/g（以水溶性VE當量計），這可能是由于大豆卵磷脂也發(fā)揮了一部分抗氧化能力。在4 ℃避光環(huán)境貯藏7 d后，兩者的ORAC值變?yōu)?1 592.97、11 703.36 μmol TE/g，分別降低了11.73%和32.14%，這說明LSOPC納米脂質體不僅總抗氧化能力更強，而且穩(wěn)定性更好。

圖14 不同質量濃度的LSOPC溶液和LSOPC納米脂質體熒光衰減圖Fig. 14 Attenuation curves of fluorescence intensity of LSOPC nanoliposome and LSOPC solution

2.1 1 抗脂質過氧化能力

圖15 LSOPC對Fe3＋/VC誘導的脂質過氧化物產(chǎn)物丙二醛的影響Fig. 15 Effect of LSOPC on the inhibition of TBARS formation induced by Fe3+/VC

如圖15所示，在Fe3＋/VC誘導的脂質過氧化反應中，空白脂質體中TBARS增加了（103±2.39）%。隨著LSOPC的加入，TBARS明顯減少，這說明LSOPC的存在能有效的減少TBARS的形成。但是TBARS變化率與LSOPC的載量沒有明顯的劑量效應關系。

3 結 論

本研究在單因素試驗結果的基礎上，經(jīng)正交試驗優(yōu)化，得到了LSOPC納米脂質體制備的最佳條件：大豆卵磷脂-膽固醇質量比3∶1、LSOPC添加量0.33 mg/mL、吐溫80添加量為16.7 mg/mL。確定了各因素對脂質體平均粒徑影響的主次順序：吐溫80添加量＞大豆卵磷脂-膽固醇質量比＞LSOPC添加量。最終得到了粒徑分布范圍在10～100 nm之間，平均粒徑為（35.57±0.08）nm的LSOPC納米脂質體。當LSOPC的載量為1%時，脂質體有最高包埋率，為（71.97±0.42）%。研究還發(fā)現(xiàn)LSOPC納米脂質體能提高LSOPC在弱堿（pH 7.4）環(huán)境中的穩(wěn)定性。食品中常用的食品添加劑，如葡萄糖、蔗糖、防腐劑，對LSOPC納米脂質體的穩(wěn)定性影響較小，只有當葡萄糖、蔗糖的質量分數(shù)達到10%以上時，脂質體的粒徑才會發(fā)生變化，而苯甲酸鈉和山梨酸鉀在所考察的質量濃度范圍內(nèi)對脂質體的穩(wěn)定性沒有顯著性影響。不同金屬離子對LSOPC納米脂質體影響不同，F(xiàn)e3＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋的加入對脂質體的粒徑有明顯的影響。通過抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，LSOPC脂質體在制備初期清除ABTS＋·和鐵還原能力不如LSOPC。但是經(jīng)過貯藏后，LSOPC溶液的抗氧化能力顯著下降，脂質體的抗氧化能力明顯高于LSOPC溶液。在ORAC法測總抗氧化能力實驗中，無論是在制備初期還是經(jīng)過貯藏后，脂質體的抗氧化能力都要優(yōu)于LSOPC溶液。通過抗脂質過氧化實驗發(fā)現(xiàn)LSOPC能夠有效的減少TBARS的生成。

參考文獻：

[1]肖俊松, 謝筆鈞, 曹雁平, 等. 蓮房原花色素的純化分級和結構鑒定[J].食品科學, 2012, 33(19): 172-177.

[2]李肖朋, 隋勇, 關亞飛, 等. 蓮原花青素低聚體對菜籽油抗氧化性的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 34(1): 115-122. DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2015.01.019.

[3]XIAO J S, XIE B J, SUN Z D, et al. Characterization of oligomeric procyanidins and identification of quercetin glucuronide from lotus(Nelumbo nucifera Gaertn.) seedpod[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(11)： 2825-2829. DOI：10.1021/jf205331e.

[4]KIM M J, SHIN H S. Antioxidative effect of lotus seed and seedpod extracts[J]. Food Science Biotechnology, 2012, 21(6)： 1761-1766.DOI：10.1007/s10068-012-0234-7.

[5]DUAN Y Q, ZHANG H, XIE B J, et al. Whole body radioprotective activity of an acetone-water extract from the seedpod of Nelumbo nucifera Geartn. seedpod[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010,48(12)： 3374-3384. DOI：10.1016/j.fct.2010.09.008.

[6]LI X P, SUI Y, LI S Y, et al. A-type procyanidins from litchi pericarp ameliorate hyperglycaemia by regulating hepatic and muscle glucose metabolism in streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice fed with high fat diet[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 27： 711-722.DOI：10.1016/j.jff.2016.08.010.

[7]XU J Q, RONG S, XIE B J, et al. Rejuvenation of antioxidant and cholinergic systems contributes to the effect of procyanidins extracted from the lotus seedpod ameliorating memory impairment in cognitively impaired aged rats[J]. European Neuropsychop Harmacology, 2009,19(12)： 851-860. DOI：10.1016/j.fct.2010.09.008.

[8]KOLECKAR V, KUBIKOVA K, REHAKOVA Z, et al. Condensed and hydrolysable tannins as antioxidants influencing the health[J].Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2008, 8(5): 436-437.DOI:10.2174/138955708784223486.

[9]WU Q, CHEN H, LV Z, et al. Oligomeric procyanidins of lotus seedpod inhibits the formation of advanced glycation end-products by scavenging reactive carbonyls[J]. Food Chemistry, 2013, 138(2):1493-1502. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.10.111.

[10]汪志慧, 孫智達, 謝筆鈞. 蓮房原花青素的穩(wěn)定性及熱降解動力學研究[J]. 食品科學, 2011, 32(7): 77-82.

[11]MCCLEMENTS D J. Design of nano-laminated coatings to control bioavailability of lipophilic food components[J]. Food Science, 2010,75(1): 30-42. DOI:10.1111/j.1750-3841.2009.01452.x.

[12]GONG K J, SHI A M, LIU H Z, et al. Preparation of nanoliposome loaded with peanutpeptide fraction: stability and bioavailability[J].Food & Function, 2016, 7(4): 2034-2042. DOI:10.1039/c5fo01612f.

[13]EDWARDS K A, BAEUMMER A J. Analysis of liposomes[J]. Talanta,2006, 68(5): 1432-1441. DOI:10.1016/j.talanta.2005.08.031.

[14]胡博, 姚薇薇, 劉寧. 原花青素脂質體的制備條件優(yōu)化[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2010, 41(9): 106-111. DOI:10.3969/j.issn.1005-9369.2010.09.020.

[15]TAN C, XUE J, FENG B, et al. Liposome as a delivery system for carotenoids: comparative antioxidant activity of carotenoids as measured by ferric reducing antioxidant power, DPPH assay and lipid peroxidation[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2014,62(28): 6726-6735. DOI:10.1021/jf405622f.

[16]WU Q, LI S Y, YANG T, et al. Inhibitory effect of lotus seedpod oligomeric procyanidins on advanced glycation end product formation in a lactose-lysine model system[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2015, 18(2): 68-76. DOI:10.1016/j.ejbt.2014.10.005.

[17]LUO X B, GUAN R F, CHEN X, et al. Optimization on condition of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) nanoliposomes by response surface methodology and cellular uptake studiesin Caco-2 cells[J]. Nanoscale Research Letters, 2014, 9(1): 291. DOI:10.1186/1556-276X-9-291.

[18]譚晨. 類胡蘿卜素脂質體的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2015: 36-46.

[19]WU Z P, GUAN R F, LYU F, et al. Optimization of preparation conditions for lysozyme nanoliposomes using response surface methodology and evaluation of their stability[J]. Molecules, 2016,21(6): 741. DOI:10.3390/molecules21060741.

[20]XIA S Q, XU S Y, ZHANG X M. Optimization in the preparation of coenzyme Q10 nanoliposomes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(17)： 6358-6366. DOI：10.1021/jf060405o.

[21]CRISTIAN M B P, ADRIANO B. Antimicrobial activity of nanoliposomes co-encapsulating nisin and garlic extract against Grampositive and Gram-negative bacteria in milk[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2016, 36： 287-293. DOI：10.1016/j.ifset.2016.07.017.

[22]鄒立強. 多酚脂質體的物化穩(wěn)定性及生理活性研究[D]. 南昌: 南昌大學, 2015: 14-28.

[23]朱蕓, 劉金榮, 成玉懷, 等. 新疆西伯利亞白刺果紅色素穩(wěn)定性的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(3): 113-115. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.03.017.

[24]李穎暢, 孟憲軍, 周艷, 等. 金屬離子和食品添加劑對藍莓花色苷穩(wěn)定性的影響[J]. 食品科學, 2009, 30(9): 80-84. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.09.019.

[25]曹伙旺, 曾秋平, 勞永民, 等. 食品添加劑對荔枝果皮花色素苷穩(wěn)定性影響的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(5): 1552-1556. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.05.031.

[26]ZENG W C, ZHANG Z, GAO H, et al. Chemical composition,antioxidant, and antimicrobial activities of essential oil from pine needle (Cedrus deodara)[J]. Journal of Food Science, 2012, 77(7):824-829. DOI:10.1111/j.1750-3841.2012.02767.x.

[27]XIA S, XU S, ZHANG X, et al. Effect of coenzyme Q(10)incorporation on the characteristics of nanoliposomes[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2007, 111(9): 2200-2207. DOI:10.1021/jp066130x.

[28]HUANG D J, OU B, HAMPSCH-WOODILL M, et al. Highthroughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC)using a multichannel liquid handing system coupled with a microplate fluorescence reader in 96-well format[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(16): 4437-4444. DOI:10.1021/jf0201529.

[29]OU B, HAMPSCH-WOODILL M, PRIOR R L, et al. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4619-4626.DOI:10.1021/jf010586o.

[30]續(xù)潔琨, 姚新生, 栗原博. 抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測定原理及應用[J]. 中國藥理學通報, 2006, 22(8): 1015-1021. DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2006.08.029.

[31]鄭衛(wèi)東, 陰文姬, 王光慈, 等. 添加物對食品乳狀液穩(wěn)定性的影響[J].食品科學, 2000, 21(4): 26-28. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2000.04.006.