不同加工處理方式對(duì)牛肉中Neu5Gc解離的影響

梁美蓮，朱秋勁*，劉春麗，王 坤

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

紅肉及其加工肉制品的安全性問(wèn)題一度引發(fā)世界性熱議，長(zhǎng)期以來(lái)的流行病學(xué)資料顯示，紅肉及其加工肉制品的攝入與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等致命性疾病密切關(guān)聯(lián)[1-3]，除了人們熟知的亞硝酸鹽、雜環(huán)胺、多環(huán)芳烴、助氧化劑亞鐵血紅素等不安全因素之外[4]，越來(lái)越多的研究證明紅肉中存在的一種酸性氨基糖——N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）與上述疾病息息相關(guān)[5-10]。

大約在2～3百萬(wàn)年前，人類編碼單磷酸胞苷-神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophos-phate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）的基因外顯子發(fā)生缺失突變，CMAH是將體內(nèi)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成Neu5Gc的關(guān)鍵酶，因此，正常人體內(nèi)不能合成Neu5Gc，但大多數(shù)哺乳動(dòng)物、以及和人類相近的類人猿都能合成Neu5Gc[11-12]。然而，在人體的上皮及內(nèi)皮細(xì)胞以及癌癥組織中卻可以檢測(cè)到Neu5Gc，這是因?yàn)镹eu5Gc可以隨著紅肉及其加工肉制品的攝入而被人體吸收和積累[13]。Neu5Gc被機(jī)體視為外來(lái)抗原，人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的Neu5Gc抗體，在Neu5Gc與Neu5Gc抗體發(fā)生反應(yīng)的過(guò)程中能夠刺激炎癥的發(fā)生，而炎癥恰恰可以促進(jìn)和加劇癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等重大疾病[14-15]。此外，紅肉易被產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌污染，其產(chǎn)生的志賀毒素若與人體腸上皮細(xì)胞中的Neu5Gc結(jié)合將導(dǎo)致胃腸道不適，引起腹瀉等癥狀，志賀毒素若與腎內(nèi)皮細(xì)胞中聚集的Neu5Gc結(jié)合破壞內(nèi)皮細(xì)胞從而導(dǎo)致溶血性尿毒癥綜合征，發(fā)生出血性腹瀉并伴隨腎衰竭等癥狀[16-18]。因此，紅肉及其加工肉制品中存在的Neu5Gc嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康。

近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，紅肉的消費(fèi)也逐漸增長(zhǎng)，加工肉制品的種類也日漸豐富，包括傳統(tǒng)的臘腸、宣威火腿、西式火腿以及培根等，這些產(chǎn)品不僅能夠滿足人們營(yíng)養(yǎng)的需求，也能滿足人們對(duì)肉制品口感的追求，然而Neu5Gc在不同加工肉制品中的含量尚不清楚，因此測(cè)定不同紅肉及其加工肉制品中Neu5Gc的含量，對(duì)人們?cè)陲嬍持袑?duì)于不同種類的紅肉以及肉制品的選擇有著重要的指導(dǎo)意義。此外，目前國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于Neu5Gc解離方法的研究，若是能為減少Neu5Gc摸索一套行之有效的方法，這對(duì)解除紅肉的安全憂患意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法檢測(cè)了不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量，探究油炸溫度、蒸煮時(shí)間、酶制劑對(duì)牛肉中Neu5Gc含量的影響，以及對(duì)Neu5Gc的解離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮豬里脊、冷鮮牛里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸、貴州香腸 貴陽(yáng)市花溪區(qū)星力超市。

Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品、1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧苯鹽酸鹽（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、β-巰基乙醇（色譜純）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（100 U/0.63 mg） 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Applichem公司；溶菌酶（20 000 U/mg）、葡萄糖氧化酶（10 kU/30.5 mg）、α-半乳糖甘酶（9 U/mg）、β-半乳糖甘酶（1 kU/6.67 mg） 北京Solarbio科技有限公司；菊粉酶（500 000 U/g） 上海寶曼生物科技有限公司；α-乙酰乳酸脫羧酶（食品級(jí)） 湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；葡萄糖異構(gòu)酶（食品級(jí)） 河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型HPLC（配有FLD和自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國(guó)安捷倫科技有限公司；LiChrosorb RP-18柱 德國(guó)默克集團(tuán)；真空冷凍干燥機(jī)、電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、超聲清洗器 寧波新芝有限公司；電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；離心機(jī) 上海盧湘儀儀器有限公司；數(shù)顯恒溫油浴鍋 上海和恒儀器設(shè)備有限公司；便攜式色差儀深圳市三恩時(shí)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

色譜柱為L(zhǎng)iChrosorb RP-18柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），柱溫30 ℃，F(xiàn)LD激發(fā)波長(zhǎng)373 nm、發(fā)射波長(zhǎng)448 nm，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-超純水（8∶7∶85，V/V），流速為0.9 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2 衍生液的配制及衍生條件

DMB衍生液的配制：8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰醋酸、0.25 mol/L硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉、0.8 mmol/L 2-巰基乙醇。

衍生條件：900 μL標(biāo)準(zhǔn)品中加入100 μL DMB衍生液，50 ℃避光衍生150 min，冷卻至室溫后分析。

1.3.3 不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc含量的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取1 g冷鮮豬里脊、冷鮮牛里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸以及貴州香腸（均取瘦肉部分）于勻漿瓶中，加入10 mL 30%的飽和硫酸銨溶液研磨成均勻的肉漿，室溫下放置1 h后13 000 r/min離心15 min，將沉淀的蛋白質(zhì)和上清液分開，沉淀和上清液分別進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后的蛋白質(zhì)沉淀和上清液粉末分別加入5 mL 2 mol/L醋酸溶解并合并，于80 ℃水浴3 h使Neu5Gc游離出來(lái)，水解后再進(jìn)行冷凍干燥除去醋酸。凍干粉溶于0.8 mL水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min進(jìn)行脫乙酰處理。精確吸取處理后的樣液900 μL，加入100 μL衍生液，用0.22 μm膜過(guò)濾后衍生，待測(cè)。

1.3.4 解離Neu5Gc酶制劑的篩選

1.3.4.1 溶菌酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取400 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入500 μL超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加3%的溶菌酶，37 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，檢測(cè)，并以未添加溶菌酶為空白對(duì)照。

1.3.4.2 葡萄糖異構(gòu)酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL的超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加3%的葡萄糖異構(gòu)酶，于60 ℃水浴2 h后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，檢測(cè)，并以未添加葡萄糖異構(gòu)酶為空白對(duì)照。

1.3.4.3 葡萄糖氧化酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確稱取0.01 g葡萄糖氧化酶溶于1 mL超純水中，取250 μL加入200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入450 μL超純水，37 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，待測(cè)，并以未添加葡萄糖氧化酶為空白對(duì)照。

1.3.4.4 α-半乳糖甘酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確稱取0.01g α-半乳糖苷酶溶于1 mL超純水中，取250 μL酶液加入200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入450 μL超純水，37 ℃水浴30 min后，再加入100 μL衍生劑，0.22 μm過(guò)濾后，待測(cè)，并以未添加α-半乳糖甘酶為空白對(duì)照。

1.3.4.5 α-乙酰乳酸脫羧酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取α-乙酰乳酸脫羧酶50 μL于200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入650 μL超純水，35 ℃水浴2 h后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，檢測(cè)，并以未添加α-乙酰乳酸脫羧酶為空白對(duì)照。

1.3.4.6 β-半乳糖甘酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

將1 kU β-半乳糖甘酶溶于1 mL超純水中，取300 μL酶液加入300 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入300 μL超純水，40 ℃水浴2 h后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)，并以未添加β-半乳糖甘酶為空白對(duì)照。

1.3.4.7 菊粉酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加0.6%菊粉酶，50 ℃水浴30 min后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)，并以未添加菊粉酶為空白對(duì)照。

1.3.4.8 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶對(duì)Neu5Gc的解離效果

將0.63 mg谷胱甘肽過(guò)氧化物酶溶于1 mL水中，準(zhǔn)確吸取500 μL于300 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入100 μL超純水，37 ℃水浴3 h后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)，并以未添加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶為空白對(duì)照。

1.3.5 菊粉酶解離Neu5Gc條件的優(yōu)化

1.3.5.1 水浴時(shí)間對(duì)菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，于50 ℃分別水浴10、30、60、90、120、150 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)。

1.3.5.2 水浴溫度對(duì)菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，分別于30、35、40、45、50、55 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)。

1.3.5.3 菊粉酶添加量對(duì)菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700μL超純水，菊粉酶添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，50 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)。

1.3.5.4 菊粉酶解離Neu5Gc條件的正交試驗(yàn)

在各單因素最適條件的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化菊粉酶解離Neu5Gc的最優(yōu)作用條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and their coded and actual levels used in orthogonal array design

1.3.6 不同處理方式對(duì)Neu5Gc解離效果的影響

1.3.6.1 油炸溫度對(duì)牛肉中Neu5Gc含量的影響

將牛里脊切成3 mm厚度均勻的切片，分別于100、125、150、175、200 ℃油溫中恒溫油炸1 min，油炸后分別準(zhǔn)確取1 g，按照1.3.3節(jié)方法對(duì)不同溫度油炸后的牛肉進(jìn)行處理，待測(cè)。為計(jì)算不同溫度油炸后牛肉中水分的損失率，每片牛肉切片油炸前后都需稱質(zhì)量。

1.3.6.2 蒸煮時(shí)間對(duì)牛肉湯中Neu5Gc含量的影響

取5 g牛里脊放入25 mL小燒杯中，加入10 mL水，蓋上保鮮膜，待水沸后放入鍋中分別蒸煮10、30、60、120、180 min。冷卻后取出肉，將肉湯進(jìn)行冷凍干燥，干燥后加入10 mL的2 mol/L醋酸溶液，80 ℃水浴3 h，冷卻后13 000 r/min離心15 min，取上清液，再次進(jìn)行冷凍干燥，凍干后加入0.8 mL超純水復(fù)溶，再加入0.2 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，37 ℃水浴30 min去乙酰化，吸取900 μL加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線的繪制

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.032 5 g Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于100 mL超純水中，配成1 mmol/L Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取濃度為1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、300、400 μL按照表2配成待衍生的混合液，衍生后采用HPLC檢測(cè)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣3 次，以3 次峰面積的平均值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

表2 不同濃度Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table 2 Preparation of Neu5Gc standard solutions of different concentrations

1.3.7.2 工作曲線的繪制

分別取濃度為1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液10、50、100、200、400 μL加入10 mL 30%的飽和硫酸銨溶液后進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后分別加入10 mL 2 mol/L醋酸溶液于80 ℃水浴3 h，再進(jìn)行冷凍干燥除去醋酸。冷凍干燥完畢后溶于0.8 mL水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液于37 ℃水浴30 min。精確吸取處理后的樣液900 μL，加入100 μL衍生液，用0.22 μm膜過(guò)濾后，衍生，待測(cè)。

1.3.8 解離率的計(jì)算

經(jīng)不同方式處理后的樣品中Neu5Gc的解離率按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：C0為空白對(duì)照中Neu5Gc含量或者峰面積；C1為不同方式處理后樣品中Neu5Gc的含量或者峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

繪圖以及統(tǒng)計(jì)分析均采用Origin 9.6軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線方程

在已有的對(duì)肉樣Neu5Gc含量的檢測(cè)研究中，直接將肉用酸水解[19]，肉中的蛋白質(zhì)遇酸發(fā)生凝膠變性，對(duì)HPLC檢測(cè)前的過(guò)濾工作帶來(lái)極大的困難，樣品損失嚴(yán)重造成結(jié)果偏小甚至過(guò)濾不出造成實(shí)驗(yàn)失敗。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肉樣的預(yù)處理進(jìn)行了優(yōu)化，先使用30%飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白質(zhì)后再進(jìn)行酸水解，解決了肉樣遇酸凝膠變性的問(wèn)題，避免了樣品的損失，更好地保證所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中所涉及到對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的處理方式不同以及對(duì)肉樣處理方式不同，肉樣的前處理又較繁瑣和復(fù)雜，因此分別繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，能更準(zhǔn)確地反映出不同方式處理后的標(biāo)準(zhǔn)液以及肉樣中的Neu5Gc含量。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.691 21x－14.386 27，R2=0.999 12，標(biāo)準(zhǔn)品在50～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；工作曲線方程為y=4.155 38x－30.060 11，R2=0.999 23，標(biāo)準(zhǔn)品在10～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量

圖1 不同種類紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量Fig. 1 Neu5Gc contents in different types of red meat and meat products

如圖1所示，冷鮮牛里脊、冷鮮豬里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸、貴州香腸中Neu5Gc含量分別為（58.45±0.98）、（17.31±0.44）、（14.31±0.55）、（18.12±0.68）、（23.07±2.1）、（27.88±0.36）、（43.19±0.63）μg/g。其中牛里脊肉中Neu5Gc含量最高，豬里脊、豬火腿腸以及豬培根中Neu5Gc含量較低。

2.3 油炸溫度對(duì)牛肉中Neu5Gc含量的影響

如圖2所示，隨著油炸溫度的升高，牛里脊肉中Neu5Gc的含量出現(xiàn)先增高后減小的趨勢(shì)，但相較于未經(jīng)油炸的牛肉空白組，經(jīng)油炸后Neu5Gc含量都有所增加，這是因?yàn)橛驼ㄟ^(guò)后，牛里脊肉中的水分被蒸發(fā)帶走，油炸過(guò)后牛肉中的干物質(zhì)含量增加，Neu5Gc在紅肉組織中主要以結(jié)合態(tài)的形式存在于糖蛋白和糖脂的糖基化末端[20-21]，因此，油炸過(guò)后牛肉中Neu5Gc含量有所增加。但是，由圖3可知，當(dāng)油炸溫度達(dá)到150 ℃以后，隨著牛肉中水分損失率的增加，牛肉中Neu5Gc含量的增加率反而減小，水分損失率與Neu5Gc之間的差值表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)橐环矫骐S著油炸溫度的升高，蛋白質(zhì)等收縮變性加劇，由Neu5Gc與脂質(zhì)結(jié)合的部分糖脂被油鍋中的油溶出，從而導(dǎo)致含量減少；另一方面，Neu5Gc與組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以糖苷鍵的形式結(jié)合[22-23]，當(dāng)油溫升高到150 ℃以上，油的酸價(jià)升高，pH值降低，使得結(jié)合態(tài)的Neu5Gc游離出來(lái)，與此同時(shí)油脂的氧化速率增加，在氧化過(guò)程中油脂分解產(chǎn)生的自由基或產(chǎn)物對(duì)游離出的Neu5Gc分子產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致Neu5Gc含量減少。有資料指出當(dāng)油炸溫度大于150 ℃時(shí)，油脂開始發(fā)生氧化產(chǎn)生有害產(chǎn)物[24]。如圖4所示，隨著油炸溫度的升高，油炸后牛肉切片的L*、a*、b*值均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)油炸溫度達(dá)到175 ℃時(shí)，L*值下降至22.16±0.29，a*值下降至6.03±0.08，b*值下降至1.76±0.02，色澤差，水分含量低，感官品質(zhì)不佳。因此，綜上所述，從油炸紅肉的安全和品質(zhì)角度出發(fā)，建議對(duì)牛肉進(jìn)行油炸時(shí)，加工溫度控制在150 ℃左右。

圖2 油炸溫度對(duì)牛肉中Neu5Gc含量的影響Fig. 2 Effects of frying temperature on the content of Neu5Gc in beef

圖3 油炸溫度對(duì)牛肉中水分損失率及Neu5Gc增加率的影響Fig. 3 Effects of frying temperatures on water loss rate and Neu5Gc increase in beef

圖4 油炸溫度對(duì)牛肉色度的影響Fig. 4 Effects of frying temperature on the color of beef

2.4 蒸煮時(shí)間對(duì)牛肉湯中Neu5Gc含量的影響

如圖5所示，隨著蒸煮時(shí)間的延長(zhǎng)，肉湯（牛里脊肉）中的Neu5Gc含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，當(dāng)蒸煮時(shí)間達(dá)10 min后，肉湯中Neu5Gc含量增加迅速，蒸煮時(shí)間達(dá)到60 min后增加速度有所減緩，到180 min時(shí)，牛肉湯中Neu5Gc含量達(dá)（32.7±0.77）μg/10 mL。另有研究證據(jù)表明當(dāng)肉的蒸煮時(shí)間超過(guò)10 min后，肉湯中的嘌呤含量迅速增加[25]，大量攝入高嘌呤的物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)[26-28]。因此，長(zhǎng)時(shí)間蒸煮的肉湯中不僅含有較多的嘌呤，還含有較高含量的Neu5Gc，不建議食用長(zhǎng)時(shí)間蒸煮后的肉湯，然而經(jīng)過(guò)高溫蒸煮后的肉，肉中的嘌呤含量減少[25]，部分Neu5Gc解離出來(lái)游離到肉湯中，肉中的Neu5Gc含量亦減少，建議食用蒸煮后的肉。

圖5 蒸煮時(shí)間對(duì)牛肉湯中Neu5Gc含量的影響Fig. 5 Effects of cooking time on the content of Neu5Gc in beef soup

2.5 酶制劑對(duì)Neu5Gc的解離效果的影響

圖6 酶制劑對(duì)Neu5Gc的解離效果Fig. 6 Dissociation effects of different enzymes on Neu5Gc

根據(jù)Neu5Gc是含有11 個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的特性，擬從食品工業(yè)糖類酶制劑中篩選出能夠解離Neu5Gc的水解酶，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)先添加足量的溶菌酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、α-半乳糖甘酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、β-半乳糖甘酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以及菊粉酶，考察這8 種酶制劑對(duì)Neu5Gc的解離效果。如圖6所示，經(jīng)過(guò)溶菌酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、α-半乳糖甘酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、β-半乳糖甘酶以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶作用后的Neu5Gc峰面積與未經(jīng)處理的無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明這些酶分子中不存在能夠與Neu5Gc分子結(jié)合并起催化分解作用的活性部位。然而經(jīng)過(guò)菊粉酶處理后的Neu5Gc峰面積與空白對(duì)照之間存在顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明菊粉酶中很可能存在某個(gè)活性中心能夠結(jié)合Neu5Gc并將之解離。

2.6 菊粉酶解離Neu5Gc優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖7 菊粉酶作用條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 7 Results of one-factor-at-a-time experiments for optimization of inulinase hydrolysis conditions

由圖7A可知，當(dāng)水浴時(shí)間達(dá)到30～60 min時(shí)酶解效果較好，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，解離效果反而下降，這很可能是因?yàn)殡S著菊粉酶的消耗，自身溫度升高會(huì)減緩酶的解離作用。由圖7B可知，隨著水浴溫度的升高，菊粉酶對(duì)Neu5Gc的解離效果也逐漸增加，當(dāng)水浴溫度在45～50 ℃之間時(shí)表現(xiàn)出較好的解離效果。由圖7C可知，隨著菊粉酶添加量的增加，其對(duì)Neu5Gc的解離效果越好，當(dāng)添加量達(dá)到0.7%后，酶解效果較佳，且解離效果不再顯著增加。

2.6.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶制劑的最適作用條件。由表3可知，影響Neu5Gc解離效果的主次因素順序?yàn)镃＞A＞B，菊粉酶的最適作用條件為A3B2C3，即水浴溫度50 ℃、水浴時(shí)間30 min、菊粉酶添加量0.8%。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 L9(34) Orthogonal array design and results

2.7 菊粉酶對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品及牛肉中Neu5Gc解離效果的比較

雖然上述研究表明，菊粉酶對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品有一定解離效果，但是肉基質(zhì)成分復(fù)雜，解離的環(huán)境條件有所不同，因此，需探究菊粉酶作用于牛肉時(shí)，其對(duì)Neu5Gc的解離效果。選取正交試驗(yàn)中獲得的最佳條件A3B2C3，并取A3B2C1以及A2B3C1兩個(gè)條件作用后的結(jié)果作對(duì)比，結(jié)果如表4所示。所得結(jié)果一方面證實(shí)了A3B2C3組合，即水浴溫度50 ℃、水浴時(shí)間30 min、菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時(shí)，對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品的解離效果最優(yōu)，解離率達(dá)（50.52±0.88）%，另一方面，相同的菊粉酶作用條件處理牛肉，僅當(dāng)水浴溫度50 ℃、水浴時(shí)間30 min、菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時(shí)，對(duì)牛肉中Neu5Gc有較小的解離作用，解離率僅為（7.29±2.67）%，其余條件下對(duì)牛肉中Neu5Gc均無(wú)解離效果，這可能是由于牛肉中物質(zhì)含量豐富，成分復(fù)雜，菊粉酶的活性可能受到肉中一些金屬離子的抑制，或是其中某些成分與Neu5Gc競(jìng)爭(zhēng)菊粉酶的同一活性中心，干擾了菊粉酶與Neu5Gc的結(jié)合，牛肉基質(zhì)的pH值與Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液不同也一定程度上抑制了菊粉酶對(duì)牛肉中Neu5Gc的解離。此外，還有可能是菊粉酶處理牛肉時(shí)，由于產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)使其催化效果降低，導(dǎo)致解離率減小。

表4 不同菊粉酶作用條件對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品及牛肉中Neu5Gc的解離效果Table 4 Dissociation efficiency of Neu5Gc standard and Neu5Gc in beef under different hydrolysis conditions with inulinase

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果顯示冷鮮牛里脊、廣式香腸以及貴州香腸中Neu5Gc含量較高。

結(jié)果表明當(dāng)油炸溫度大于150 ℃時(shí)，牛肉中的Neu5Gc損失開始增大，雖然油炸溫度達(dá)到150 ℃后，隨著油炸溫度的升高，Neu5Gc的損失也隨之增大，但是，從油炸紅肉的安全和品質(zhì)角度出發(fā)，建議對(duì)紅肉進(jìn)行油炸時(shí)，加工溫度控制在150 ℃左右。

蒸煮時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)肉湯中Neu5Gc的含量也有影響，隨著蒸煮時(shí)間的延長(zhǎng)，肉湯中的Neu5Gc含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，當(dāng)蒸煮時(shí)間達(dá)到180 min時(shí)，牛肉湯中Neu5Gc含量達(dá)（32.7±0.77）μg/10 mL。長(zhǎng)時(shí)間蒸煮的肉湯中含有較高含量的Neu5Gc，不建議食用長(zhǎng)時(shí)間蒸煮后的肉湯，然而經(jīng)過(guò)高溫蒸煮后的肉中的Neu5Gc含量減少，建議食用蒸煮后的肉。

本實(shí)驗(yàn)從多種酶制劑中篩選出對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品具有解離作用的菊粉酶，探究了菊粉酶對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品解離的最適作用條件，通過(guò)正交試驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)菊粉酶水浴溫度50 ℃、水浴時(shí)間30 min、酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時(shí)，對(duì)Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品的解離效果最優(yōu)，解離率達(dá)到了（50.52±0.88）%，然而，由于牛肉成分復(fù)雜，篩選出的條件作用在牛肉基質(zhì)中，卻未有如此理想的解離效果。

本研究不僅為人們的日常飲食提供了科學(xué)指導(dǎo)，也為開展宰前宰后紅肉中Neu5Gc安全穩(wěn)妥的去除方法提供了依據(jù)。目前，關(guān)于菊粉酶解離Neu5Gc的機(jī)制尚不清楚，仍需深入探究獲取其動(dòng)力學(xué)變化信息，菊粉酶作用于紅肉基質(zhì)的最適條件也需進(jìn)一步挖掘。

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