黑果枸杞根際促生菌篩選與特性研究

馬驄毓，姚 拓(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物根際生存著一類有益菌類[1]，不僅可以固定空氣中的氮?dú)猓€可溶解土壤中不能被植物直接利用的磷元素，或分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而促進(jìn)植物對(duì)礦物質(zhì)的吸收和生長(zhǎng)發(fā)育[2]。這類細(xì)菌被稱為植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱 PGPR)。通過(guò)利用具有固氮、溶磷、活鉀、分泌生長(zhǎng)素等功能的植物根際促生菌研制生物菌肥，對(duì)改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量、改良鹽堿地及環(huán)境保護(hù)具有積極作用[3-4]。生物菌肥相比傳統(tǒng)化肥具有成本低、使用安全、持續(xù)效果好、增產(chǎn)穩(wěn)定、非再生能源消耗少、經(jīng)濟(jì)效益高、無(wú)環(huán)境和食品污染等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物肥料已有規(guī)?；纳a(chǎn)，但在不同環(huán)境、不同植物根際的菌株不同，且不同菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性也不同。因此，借鑒已有研究經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)特定地區(qū)的氣候、植物及環(huán)境，分離篩選高效菌株，從而研究具有地區(qū)針對(duì)性的生物菌肥具有重要意義[5-7]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科(Solanceae)枸杞屬(Lycium)多年生灌木，是一種稀鹽鹽生植物，廣泛分布于我國(guó)陜西北部黃土高原、寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆和西藏等地區(qū)[8]，在甘肅境內(nèi)主要分布在瓜州、敦煌、金塔和民勤的鹽化荒漠地帶[9]。由于特殊的外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征及抗鹽機(jī)理，黑果枸杞具有適應(yīng)能力強(qiáng)、抗旱、耐鹽的特點(diǎn)[10]，是待開(kāi)發(fā)利用的干旱、半干旱地區(qū)植被恢復(fù)重建的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[11]。近年來(lái)，研究多集中在鹽脅迫下黑果枸杞的生理生態(tài)機(jī)制和種子萌發(fā)[12-13]，或干旱條件下黑果枸杞的生理防御機(jī)制[14]，以及黑果枸杞的藥用價(jià)值和保健作用[15]，目前，對(duì)干旱地區(qū)黑果枸杞根際微生物的相關(guān)研究報(bào)道較少。

因此，篩選黑果枸杞根際PGPR菌，獲得具有促生特性的優(yōu)良菌株，并將其運(yùn)用于黑果枸杞專用生物肥料的研制和生產(chǎn)，不僅對(duì)促進(jìn)黑果枸杞的種植業(yè)發(fā)展具有積極意義，而且對(duì)改良土壤結(jié)構(gòu)、修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用，并為生物肥料下一步開(kāi)發(fā)利用打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

采樣地位于甘肅省民勤縣退耕區(qū)次生草地，試驗(yàn)于2015年8月在采樣地利用五點(diǎn)法獲取黑果枸杞根際(根系和土壤)樣品，存貯于無(wú)菌采樣袋中低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行PGPR菌株分離(4℃保存不超過(guò)24 h)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于分離和保存根際細(xì)菌[16]；NFM培養(yǎng)基用于固氮菌的分離純化[17]；PKO培養(yǎng)基用于溶解無(wú)機(jī)磷菌株的分離與純化[18]；蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基用于溶解有機(jī)磷菌株的分離與純化[16,19]。

1.3 方法

1.3.1 根際促生菌的分離與純化 根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法，將根際分為3個(gè)部分，即根表土壤(soil adhering to roots,RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots,RP)、根內(nèi)(histoplan or interior of roots,HP)。

稱取樣品2 g，置于50 mL離心管中，注入18 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水，振蕩2 min并靜置后即為10-1根表土壤稀釋液，然后依次制備成濃度為10-3，10-4和10-5的稀釋液，備用。用微量移液器分別吸取50 μL已制備好的3個(gè)根系區(qū)域的10-3，10-4和10-5稀釋液，接種于滅菌的NFM、PKO和蒙金娜固體培養(yǎng)基上，立即用無(wú)菌玻璃涂布器涂抹均勻，根際3個(gè)區(qū)域每個(gè)濃度均重復(fù)3次，倒置20 min。接種后的培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用接種針從NFM培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)良好且形狀不同的單個(gè)菌落，從PKO和蒙金娜培養(yǎng)基上挑取具有溶磷透明圈的菌落，利用劃線法純化后接種于LB斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

NFM培養(yǎng)基中呈黃綠色的菌落，挑取其中單個(gè)菌落，并分別接種在新的PKO無(wú)機(jī)磷、蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基，從而獲得可溶磷的目標(biāo)菌落。

1.3.2 固氮菌固氮酶活性測(cè)定 色譜條件：玻璃柱長(zhǎng)2 m，內(nèi)徑0.4 cm，擔(dān)體GDX-502，柱溫170℃，檢測(cè)器溫度150℃，進(jìn)樣器溫度140℃，氣體流量為H20.08 kg/cm，空氣0.15 kg/cm，N20.3 kg/cm，檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。

將純的標(biāo)準(zhǔn)C2H4氣體(純度為99.999%)配置為濃度10、25、50、75、100、200、500、1 000 μL/10 mL的C2H4標(biāo)準(zhǔn)混合氣體，用50 μL微量進(jìn)樣器從C2H4標(biāo)準(zhǔn)混合氣體抽取50 μL注入氣象色譜儀(GC 7890F)進(jìn)樣柱中，觀察 C2H4峰的峰面積。最后以C2H4濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，即得到C2H4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活計(jì)算采用乙炔還原活性參照中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所方法進(jìn)行計(jì)算[20]。

1.3.3 溶磷菌溶磷能力測(cè)定 (1)定性測(cè)定 將活化后的菌株點(diǎn)接種于PKO和蒙金娜固體培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)，在7～10 d時(shí)觀察每菌株是否出現(xiàn)溶磷透明圈，并測(cè)量每菌株溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)，由比值大小初步判定菌株的溶磷能力；(2)定量測(cè)定 在已滅菌的PKO或蒙金娜液體培養(yǎng)基中接種0.5 mL各菌株菌懸液(OD值為0.5)。每菌株3次重復(fù)，不接種為對(duì)照。28℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 d后，用酸度計(jì)測(cè)定各個(gè)培養(yǎng)液pH值，后將培養(yǎng)液在10 000 r/min、4℃離心15 min后，取其上清液5 mL于150 mL錐形瓶中并加入45 mL 0.5 mol/L NaHCO3和約1.5 g無(wú)磷活性炭，封口振蕩 30 min，無(wú)磷濾紙過(guò)濾。在50 mL容量瓶中加入濾液1 mL、0.5 mol/L NaHCO35 mL以及蒸餾水約30 mL，最后加入5 mL鉬銻抗顯色劑，定容搖勻。顯色30 min后，進(jìn)行比色，測(cè)定D700nm，計(jì)算磷濃度(μg/mL)。

1.3.4 PGPR菌株鑒定 (1)生理生化特性測(cè)定 將各菌進(jìn)行接觸酶反應(yīng)、V-P測(cè)定、D-葡萄糖產(chǎn)酸、D-木糖產(chǎn)酸、D-木聚糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣、明膠水解、酪朊水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、吲哚產(chǎn)生、氧化酶測(cè)定等試驗(yàn)，準(zhǔn)確觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果；(2)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 用細(xì)菌基因組DNA試劑盒(OMEGA，美國(guó))提取各菌DNA；用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度的測(cè)定；擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增的通用引物27F-1492R(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)，由上海派森諾生物有限公司合成。

擴(kuò)增體系(25 μL)：10×buffer緩沖液(2.5 mmol/L)2.5 μL，Mg2+(10 mmol/L)1.5 μL ，dNTP(25 mmol/L)0.5 μL ，27F(10 μmol/L)0.5 μL ，1492R(10 μmol/L)0.5 μL ，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，模板DNA(25 ng/μL)2.0 μL，稀釋至25 μL。PCR反應(yīng)程序：93 ℃預(yù)變性3～5 min，94℃變形30 s，55退火60 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30～35次，72℃保溫10 min，4℃保存。DNA Marker為DL200(上海派森諾生物有限公司)，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物并交公司完成。

將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中用 megablast進(jìn)行相似性搜索，并與已報(bào)道細(xì)菌菌株的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA 5.0生物學(xué)軟件構(gòu)建進(jìn)化距離樹(shù)圖，用 Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理及制圖采用 Excel 2013，數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際促生菌的分離純化

利用NFM、PKO和蒙金娜選擇培養(yǎng)基分離出生長(zhǎng)較快、菌落較大，且具有明顯溶磷圈的菌株。純化后獲得菌株71株，其中固氮菌21株，溶解無(wú)機(jī)磷菌株30株，溶解有機(jī)磷菌株20株。均表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>根內(nèi)(HP)的數(shù)量分布規(guī)律，即表現(xiàn)出很強(qiáng)的根際效應(yīng)(表1)。

表1 黑果枸杞根際促生菌株來(lái)源及分布Table 1 Source and distribution of Lycium ruthenicum Murr rhizosphere strains

2.2 PGPR菌株的固氮酶活性

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用不同濃度的乙烯混合氣體作為橫坐標(biāo)，峰面積值作為縱坐標(biāo)作圖，得到乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

2.2.2 固氮酶活性測(cè)定 經(jīng)乙炔還原法所測(cè)定的21株固氮菌株中，有10株菌株的固氮酶活性較為良好(表2)，固氮酶活性在56.48～365.12 nmol C2H4h/mL，且各菌株之間的固氮酶活性差異較大，其中菌株NDRP5的固氮酶活性最高，菌株NDRP3的固氮酶活性最低，共有7個(gè)菌株的固氮酶活性大于200 nmol C2H4/(h·mL)。在10株菌株中，7株菌株產(chǎn)酸，1株菌株為中性，2株菌株產(chǎn)堿。

圖1 乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of C2H4

表2 固氮菌株的固氮酶活性Table 2 Nitrogenase activity of nitrogen fixing bacteria nmol C2H4/(h·mL)

2.3 PGPR菌株的溶磷能力

2.3.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別準(zhǔn)確吸取5 μg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，采用鉬銻抗比色法進(jìn)行顯示、比色，以梯度磷溶液的吸光值(D700nm)為縱坐標(biāo)，梯度磷溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of phosphorus

2.3.2 菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力 供試的30株菌株中有15株菌株溶磷圈較大，生長(zhǎng)速度較快，具有良好的溶解無(wú)機(jī)磷的能力，有7株菌株為NFM固氮培養(yǎng)基上篩選出的產(chǎn)酸菌株(表3)。通過(guò)溶磷圈法定性測(cè)定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d值在1.59～3.39，D/d值最大的菌株為NDRS5，D/d值最小的菌株為PDRS1。溶磷量在30.80～574.40 μg/mL，菌株P(guān)DRS1溶磷量最高，菌株P(guān)DRP1溶磷量低，溶磷量高于300 μg/mL的菌株共9株，各菌株在PKO培養(yǎng)基上pH在5.06～6.43，均偏堿性。

表3 菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力測(cè)定Table 3 Capacity of strains on inorganic culture medium

2.3.3 菌株溶解有機(jī)磷能力 供試的20株菌株中選取溶磷圈較大，生長(zhǎng)速度較快的15株進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，其中，有8株為NFM固氮培養(yǎng)基上篩選出的產(chǎn)酸和中性菌株(表4)。通過(guò)溶磷圈法定性測(cè)定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d在1.78～3.11，D/d值最大的菌株為MDRS1，最小的菌株是NDRS4。定量測(cè)定的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)供試的15株菌株溶解有機(jī)磷量分別為64.88～429.38 μg/mL，溶磷量最大的菌株為MDRP3，最小的菌株是MDRS1，溶磷量高于300 μg/mL的菌株共4株。各菌株在蒙金娜培養(yǎng)基上pH4.74～6.20，多數(shù)菌株偏堿性。

表4 菌株溶解有機(jī)磷能力測(cè)定Table 4 Capacity of strains on organic culture medium

2.4 優(yōu)良菌株鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 試驗(yàn)結(jié)果表明，選取性能較好的6株菌株P(guān)DRS1、PDRP3、NDRS4、NDRP5、NDHP1及MDRP5進(jìn)行鑒定(表5)。查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》以及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》后，初步鑒定各菌株為芽孢桿菌屬[21-22]。

注：“+”代表該反應(yīng)為陽(yáng)性，“-”代表該反應(yīng)為陰性

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 綜合生化試驗(yàn)結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)研究中所分離的菌株生化鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果能很好的吻合，說(shuō)明鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠(表6，圖3)。6株菌株分別屬于芽孢桿菌屬的3個(gè)種，其中，PDRS1、PDRP3、NDRP5和NDHP1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，NDRS4為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，MDRP3為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

表6 優(yōu)良PGPR菌株鑒定結(jié)果Table 6 Identification of PGPR

圖3 分離出的溶磷菌株分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated phosphate solubilizing bacteria strains

3 討論

大自然中微生物的種類很多，僅有極少數(shù)的微生物種類得到了鑒定[23]，能在試驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物種類就更少，僅為1%[24]。在傳統(tǒng)方法中對(duì)植物根際細(xì)菌鑒定分類主要采用微生物培養(yǎng)的方法，即通過(guò)觀察細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)和生理生化指標(biāo)來(lái)完成鑒定[25]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和進(jìn)步，菌株鑒定和分離有了更為可靠快速的方法和手段。目前，最常用的微生物菌種鑒定技術(shù)就是16SrDNA序列分析技術(shù)，能夠較好完成菌株遺傳特性篩選和分子差異比對(duì)，現(xiàn)已將鑒定出的細(xì)菌的16SrDNA基因信息建立數(shù)據(jù)庫(kù)，全部收錄到GenBank等基因數(shù)據(jù)庫(kù)。此次研究將生理生化特性與分子生物學(xué)方法相結(jié)合后對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果更為準(zhǔn)確。

在分離、純化具有固氮能力、溶解無(wú)機(jī)磷和溶解有機(jī)磷能力菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)各菌株數(shù)量均表現(xiàn)出根表>根表土>遠(yuǎn)根土>根內(nèi)的根際分布趨勢(shì)，此研究結(jié)果與姚拓等[26-27]、張英及趙小蓉等[28-30]的研究結(jié)果相一致。由此說(shuō)明PGPR菌株在土壤中的數(shù)量除了受土壤理化性質(zhì)、有機(jī)質(zhì)含量、土壤類型、耕作措施等因素影響外，PGPR菌株的分布同時(shí)也受植物強(qiáng)烈的根際效應(yīng)的影響。有研究表明接近根表的菌株更容易獲取植物分泌的某些物質(zhì)，從而聚集更多的微生物[31]；同時(shí)，由于土壤表層積累的枯葉和根系分泌物較多，使得土壤表層和植物根系表層土壤的細(xì)菌生長(zhǎng)可以獲得豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[32]。另外，不同植物的根際促生菌組成必然不同，因此，要開(kāi)發(fā)促生效果良好的促生菌產(chǎn)品，就需從不同地區(qū)不同植物的根際分離，從而選育出具有地區(qū)針對(duì)性的優(yōu)良菌株。

獲得的固氮、溶磷菌株經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，該屬除了具有良好的解磷能力[33]，還具有良好的固氮作用和生防作用[34]。大量存在于植物根際，繁殖快速、能分泌高活性的分解酵素，并合成多種有機(jī)酸、酶、生理活性等物質(zhì)，成為植物位點(diǎn)和空間微環(huán)境的有力競(jìng)爭(zhēng)者。孫廣正等[35]分離出的一株枯草芽孢桿菌對(duì)油菜菌核病病原菌的抑制率達(dá)到了85%。王玉琴等[36]從針茅中分離獲得菌株265ZY4，鑒定為枯草芽孢桿菌，具有溶磷、產(chǎn)IAA等生物學(xué)功能，具有較好的開(kāi)發(fā)潛力。除枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，研究還獲得芽孢桿菌屬的其他一些常見(jiàn)的PGPR菌種，如短小芽胞桿菌(B.pumilus)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)[37-38]。研究分離出菌株，參考前人文獻(xiàn)推測(cè)其有拮抗病原菌的潛力，對(duì)抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營(yíng)養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境具有積極作用。

4 結(jié)論

黑果枸杞根際有大量PGPR菌，分布特征表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>根內(nèi)(HP)的根際效應(yīng)；最終獲得71株P(guān)GPR菌，其中固氮菌21株，溶解無(wú)機(jī)磷30株，有機(jī)磷20株；通過(guò)對(duì)促生特性研究，7株固氮菌株的固氮酶活性大于200 nmol C2H4/(h·mL)，13株溶磷菌株的溶磷量高于300 μg/mL；篩選出綜合性能良好、有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的PGPR菌株6株，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中Bacillussubtilis有4株，Bacilluspumilus和Bacilluscereus各1株。

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