化妝品刺激性評價方法的研究進展

徐曉明

摘 要：隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，化妝品行業(yè)也迎來了發(fā)展高峰期。目前化妝品的種類繁多，其品質(zhì)也是參差不齊，但是都在一定程度上對皮膚有一定的刺激性。本文綜述了目前法規(guī)認可的國內(nèi)外化妝品刺激性評價的體內(nèi)和體外替代方法，重點從原理、方法、應(yīng)用等方面介紹了眼睛、皮膚刺激、腐蝕性評價體外替代方法，共包括9種眼刺激、腐蝕性、3種皮膚腐蝕性、1種皮膚刺激性評價方法。最后提出體外替代方法雖然有待進一步成熟，但已經(jīng)成為全球發(fā)展趨勢，而我國應(yīng)結(jié)合國情積極建立相應(yīng)的體外替代方法。

關(guān)鍵詞：化妝品；刺激性評價；方法；研究

1前言

刺激性物質(zhì)作用于機體后可能引發(fā)機體產(chǎn)生刺激、過敏等一系列的生理、生化反應(yīng)，其中最主要的是刺激反應(yīng)，可導(dǎo)致水腫、紅斑、瘙癢、疼痛等癥狀。包括歐美國家在內(nèi)的多國化妝品法規(guī)均明確規(guī)定了化妝品原料和產(chǎn)品應(yīng)進行相應(yīng)的眼睛、皮膚的刺激性安全評價。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中“毒理學試驗方法”規(guī)定，化妝品新原料需進行皮膚和急性眼刺激性、腐蝕性試驗，同時化妝品產(chǎn)品在投放市場前，對于每天使用的化妝品需進行多次皮膚刺激性試驗；對于間隔1日或數(shù)日使用或使用后沖洗的化妝品需進行急性皮膚刺激性試驗；使用時可能與眼睛接觸的產(chǎn)品需進行急性眼刺激試驗。長期以來，皮膚、眼睛刺激性試驗主要依賴動物試驗，Draize兔眼試驗是測定急性眼刺激的國際標準方法，Draize試驗也是國際公認的動物皮膚刺激性試驗標準。

近年來，以歐盟為首的全球眾多國家和地區(qū)紛紛呼吁禁止在化妝品安全評價中使用動物試驗：歐盟2004年開始禁止化妝品成品動物試驗和禁止銷售經(jīng)過動物試驗的化妝品成品，2013年3月全面禁止化妝品動物試驗并禁止銷售經(jīng)過動物試驗的化妝品；新西蘭自2015年5月起禁止在化妝品及成分研究、制造、測試和教學中使用動物試驗；印度自2014年11月起禁止進口經(jīng)過動物試驗的化妝品等。禁止動物試驗在化妝品安全性評價中的使用已成為全球趨勢，推動了替代動物試驗的體外評價方法的開發(fā)和應(yīng)用。

2眼刺激評價

在某些情況下，眼睛可能成為化妝品及其成分作用的靶器官或吸收途徑，從而引起眼刺激、腐蝕，故眼刺激、腐蝕性的評價是化妝品及其成分安全性評價的必要內(nèi)容。目前，常用的方法有體內(nèi)和體外替代法，體內(nèi)方法已使用多年，近幾十年對體外替代方法進行了大量的研究與驗證。

2.1體內(nèi)試驗方法

兔眼試驗在2008年前是測定急性眼刺激的國際標準方法，目前仍是我國化妝品法規(guī)中規(guī)定的眼刺激性、腐蝕性評價的標準。雖然長期以來，兔眼試驗被認為是評估眼刺激性、腐蝕性的唯一標準方法，但該方法試驗周期長、成本高，且動物試驗結(jié)果與人體仍有一定的差異性，其科學性及合理性有待進一步驗證。

2.2體外試驗方法

至今，已有多種動物替代試驗的體外方法被開發(fā)和應(yīng)用。其中已有5種方法得到了OECD的認可，2種經(jīng)過了ECVAM的驗證。

2.2.1牛角膜渾濁和滲透性試驗

BCOP法利用離體牛眼角膜，將受試物直接與牛角膜接觸，刺激物可導(dǎo)致角膜上皮屏障功能破損和基質(zhì)蛋白變性，將牛角膜的渾濁度和滲透性作為毒理學的評價指標，根據(jù)公式計算與兩個指標數(shù)值相關(guān)的體外刺激分數(shù)（InVitroIrritancyScore，IVIS），通過評分進行分類：若IVIS>55，則受試物具有嚴重眼刺激性，不需要其他方法驗證；IVIS≤3，則無刺激性；若3

2.2.2離體雞眼試驗

ICE法利用短期離體培養(yǎng)的雞眼球進行眼刺激檢測。取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過肉眼檢查、測量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透評價角膜損傷程度，將角膜膨脹度、角膜渾濁度和熒光素滯留度的數(shù)值作為毒理學終點，根據(jù)終點數(shù)值分別對三個評價維度進行ICE分類，包括I、II、III、IV，最后通過三個評價指標的終點組合分析：（1）若終點組合為3×I、2×I和I×II，則無刺激性；（2）若終點組合為3×IV、2×IV和I×II、2×IV和1×II、2×IV和IV×I、30min時角膜渾濁度≥3（至少兩只眼球）、任何時間點角膜渾濁度=4（至少2只眼球）、上皮嚴重松弛（至少1只眼球），則有嚴重眼損傷和眼腐蝕；（3）若為其他情況，則無法判斷。ICE法可用于鑒別化學物的眼腐蝕和嚴重眼損傷或無刺激性，但無法區(qū)分嚴重眼刺激、眼損傷。該方法適用于固體、液體、乳劑、凝膠狀化合物。

2.2.3熒光素漏出試驗

FL法是一項基于細胞毒性和細胞屏障功能的眼刺激替代試驗。將受試物暴露后，以導(dǎo)致培養(yǎng)的單、多層細胞20%熒光素漏出的受試物的濃度FL20（mg/ml）作為評價指標，若FL20≤100mg/ml，即可確定受試物可導(dǎo)致眼腐蝕性和嚴重刺激性。FL法在國外獲得了大量的驗證研究，OECD指南推薦將FL法用于體外試驗“自上而下”分層組合策略中，初步篩選眼腐蝕性、嚴重刺激性的受試物，但不推薦用于輕微、弱刺激性的評估，以及眼刺激性的分類。FL法僅適用于在規(guī)定條件下的水溶性無色物質(zhì)，不包括強酸、強堿、細胞固定劑、強揮發(fā)性物質(zhì)，會產(chǎn)生凝固、皂化或其他特殊反應(yīng)的化學物同樣不適用。

2.2.4短期暴露試驗

引起角膜上皮細胞的細胞毒性是化學物引起角膜上皮損傷和眼刺激的重要作用方式，STE法利用兔眼角膜細胞（SIRC），將受試物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法測定細胞吸光度，通過計算受試物暴露后引起角膜上皮的細胞生存率判斷受試物的眼刺激性。若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細胞生存率≤70%，則該受試物有刺激性；反之，若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細胞生存率大于70%，則無眼刺激性。

3皮膚刺激、腐蝕性評價

化妝品原料及產(chǎn)品對皮膚的損傷主要包括皮膚刺激性和腐蝕性，皮膚刺激性是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性損傷，腐蝕性指的是不可逆損傷，體內(nèi)和體外替代試驗是常用的方法，其中體外替代方法正成為趨勢。

3.1體內(nèi)試驗

標準動物皮膚刺激性試驗是Draize試驗，也是國際公認的標準。常規(guī)的人體試驗是斑貼試驗，根據(jù)觀察志愿者斑貼部位是否有紅斑、浸潤、水腫、丘疹等臨床表現(xiàn)分級并評估。若受試物刺激反應(yīng)小，人體試驗臨床表現(xiàn)不明顯，為了全面評估受試物的刺激性，可通過生物工程技術(shù)進行評價，如通過檢測經(jīng)皮水分流失（TransepidermalWaterLoss，TEWL）評估皮膚屏障功能，TEWL值越大，表明皮膚屏障功能受損越嚴重。

3.2體外試驗

目前已經(jīng)有多種皮膚刺激、腐蝕性體外替代方法經(jīng)過了OECD、ECVAM的驗證與認可。

人表皮模型主要是將由人體取得的角質(zhì)形成細胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，完全分化至具有多層皮膚結(jié)構(gòu)的三維人體表皮模型。經(jīng)過驗證的主要有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyteEPI-MODEL24SIT四種模型，將受試物涂抹于皮膚模型，暴露一定時間后用MTT法測試細胞存活率，若細胞存活率>50%，則該物質(zhì)對皮膚無刺激；若細胞存活率≤50%，則該物質(zhì)有皮膚刺激性，但無法對刺激性進一步分類。

4結(jié)束語

體外科學技術(shù)的發(fā)展極大地促進了替代方法的研究開發(fā)，世界各國在嚴禁動物試驗和推行替代方法的法規(guī)上的認識逐漸統(tǒng)一，雖然目前替代方法的開發(fā)和驗證有待進一步成熟，如何將具有不同預(yù)測能力和使用范圍的體外方法科學合理地整合，提高替代方法的準確度、精密度等都是以后的研究重點，但毫無疑問替代方法在化妝品安全性評價中的使用已成為全球趨勢。