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    G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的影響及其機制

    2018-05-21 08:34:34裴慧王立啟王磊王維畢秀萍才曉君蘇國海趙卓
    中國循環(huán)雜志 2018年5期
    關鍵詞:偶聯(lián)結果顯示空白對照

    裴慧,王立啟,王磊,王維,畢秀萍,才曉君,蘇國海,趙卓

    內源性雌激素對女性絕經前心血管內環(huán)境的穩(wěn)定起重要的調節(jié)作用[1],能延緩高血壓、心力衰竭和冠狀動脈疾病的發(fā)展。絕經后雌激素替代療法對心血管疾病具有保護作用[2,3]。最初研究證實,雌激素主要通過經典雌激素受體ERα和ERβ來調控基因的轉錄進而保護心血管系統(tǒng)[4,5]。隨著研究的深入,G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)作為雌激素受體的功能被發(fā)現(xiàn)[6],國際藥理學聯(lián)合會(IUPHAR)也將GPR30或G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPER1)分類為膜雌激素受體。

    GPER1參與雌激素介導的基因轉錄和信號通路的調節(jié)[7]。GPER1主要通過快速非基因組機制參與雌激素信號的傳導,如細胞應答效應中的鈣動員、激酶激活及一氧化氮產生等[8]。近年來,特異性GPER1激活劑G1(簡稱G1)[9]和抑制劑G15(簡稱G15)的合成,為其藥理學和生理學的研究開辟了新途徑。研究發(fā)現(xiàn),G1作用于內皮細胞、血管平滑肌細胞和腎素-血管緊張素系統(tǒng),產生舒張血管[10]、降低血壓[11]、抗炎[12]、防止心肌再灌注損傷[13]、緩解肺動脈高壓[14]等心血管保護作用。

    雖然GPER1具有潛在的心血管保護作用,但其在緩解心肌細胞肥大中的作用機制仍未闡明。本研究通過串聯(lián)質譜標簽(TMT)蛋白質譜技術和生物信息學分析進行大數(shù)據分析,通過蛋白免疫印跡法(Western-blot)和熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)技術探究其可能的調控機制。

    1 材料與方法

    材料與試劑: G1、G15(Cayman Chemical,美國),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國),胎牛血清(Gibico,美國)、馬血清(BI,以色列),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、抗GPER1抗體(Abcam,美國),抗絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抗體、抗p-AKT抗體、抗細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體、抗p-ERK抗體、抗LC3抗體和抗GAPDH抗體(CST,美國),二抗HRP(Proteintech,中國),Alexa Fluor 488抗體(Life Technologies,美國),4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DIPI,Thermo Fisher Scientific,美國),qRT-PCR試劑盒(TAKARA,日本)和流式試劑盒(BD,美國)。

    細胞培養(yǎng):2~3日齡的新生Wistar乳鼠50只(購自山東大學動物實驗中心)表皮消毒后,摘取心臟并剪碎成2~3 mm3的組織塊,胰蛋白酶(0.1%)重懸置于磁力攪拌器消化10 min。5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,800 g離心10 min后收集細胞。DMEM高糖培養(yǎng)基(含有6%馬血清、8%新生牛血清和1%青霉素/鏈霉素),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h。

    模型建立和分組:心肌細胞血清饑餓后,AngⅡ(0 、50 、100 和250 nmol/L)誘導心肌細胞肥大。檢測信號通路檢測實驗分為6組:空白對照組、AngⅡ 組、AngⅡ +G1組、AngⅡ +G1+G15組、AngⅡ+G1+ERK抑制劑 (U0126)組和AngⅡ+G1+AKT抑制劑 (MK2206)組??瞻讓φ战M不給藥;AngⅡ組給予AngⅡ(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1組給予AngⅡ(100 nmol/L)和G1(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1+G15組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和G15(100 nmol/L)處理;AngⅡ +G1+U0126組 給 予 AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L) 和 U0126(100 nmol/L) 處 理;AngⅡ+G1+MK2206組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和 MK2206(5 μmol/L)處理。各組n=3。

    蛋白質譜分析:檢測空白對照組、AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(100 nmol/L)組的蛋白表達差異。用軟件Mascot2.5和Proteome Discoverer2.1,篩選出差異倍數(shù)>1.2,P<0.05的差異蛋白分子。

    細胞免疫熒光染色:心肌細胞4%多聚甲醛固定20 min,0.5%Triton X-100細胞膜通透劑室溫通透20 min,血清封閉。GPER1抗體1:300稀釋4℃孵育過夜,PBST(PBS+Tween-20洗液,pH=7.4)浸洗后,熒光二抗避光孵育1 h,DAPI避光孵育10 min,鏡下觀察采集圖像。

    Western-blot: 6 孔板加入 100 μl RIPA 裂解液和1%PMSF蛋白酶抑制劑裂解細胞,超聲粉碎,4℃12 000 g離心,取上清蛋白定量。25 μl 5 X loading buffer 混勻后100℃水浴,-80℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,90 V恒壓電泳,250 mA恒流轉膜,5%脫脂奶粉封閉,洗膜,抗體1:1 000稀釋4℃孵育過夜。TBST洗液漂洗后,二抗1:1 0000孵育1 h,漂洗后化學發(fā)光法顯色。

    qRT-PCR檢測: Trizol法提取總RNA后,按Takara試劑盒說明書要求行cDNA逆轉錄。所有引物購自Takara公司,引物序列:心房鈉尿肽(ANP)上 游 引 物5'-CGTATACAGTGCGGTGTCCA-3',下 游 引 物 5'-GGTTGACTTCCCCAGTCCAG-3';B型 利 鈉 肽(BNP) 上 游 引 物5'-AGCTGCTGGAGCTGATAAGAG-3', 下 游 引 物5'-CTGCCCAAAGCAGCTTGAAC-3';GPER1 上 游 引物5'-CCATCATCGGCCTGTGCTAT-3',下游引物5'-GAAGACAAGGACCACTGCGA-3';GAPDH 上游引物5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

    統(tǒng)計學方法:數(shù)據采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進行分析。計量資料以±s表示,組間比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大

    Ang Ⅱ(0、50、100 和 250 nmol/L)誘導心肌細胞24 h。各組心肌細胞表面積分別為(1 343.6±202.9)μm2,(1 657.3±168.6)μm2,(2 603.1±381.7)μm2, (3 350.0±413.3)μm2。qRT-PCR檢測結果,與空白對照組相比,AngⅡ(100 nmol/L) 組的心肌細胞表面積明顯增大(P<0.01)。

    2.2 心肌細胞中存在G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達(圖 1)

    圖1 細胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應監(jiān)測心肌細胞G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達

    心肌細胞特異性免疫熒光(抗GPER1,綠光)染色結果顯示(圖1A),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1蛋白表達均較空白對照組明顯增加。Western-blot結果顯示(圖1B),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1蛋白表達水平均較空白對照組略有升高(P均<0.05),AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組對GPER1蛋白表達無差異(P>0.05)。qRT-PCR結果顯示(圖1C),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1 mRNA水平均較空白對照組均明顯升高(P均<0.05)。

    2.3 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1可以降低心肌細胞心房鈉尿肽和B型利鈉肽信使核糖核酸水平(圖2)

    GPER1激活劑G1(10、100和1 000 nmol/L)和AngⅡ(100 nmol/L)共同作用于心肌細胞。qRT-PCR結果顯示,與空白對照組相比,AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(10、100和1 000 nmol/L)組肥大心肌細胞ANP和BNP mRNA水平均明顯升高(P<0.01)。隨著G1濃度的升高,ANP和BNP mRNA水平基本呈梯度降低,尤其是AngⅡ+G1(100、1 000 nmol/L)組與AngⅡ(100 nmol/L)組相比ANP和BNP mRNA水平均明顯降低(P均<0.05)。

    圖2 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測濃度梯度G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1激活劑對心肌細胞心房鈉尿肽(2A) 和B型利鈉肽信使核糖核酸(2B)的影響

    2.4 各組乳鼠心肌細胞蛋白質質譜分析

    蛋白質譜分析顯示:空白對照組與AngⅡ組組間差異蛋白52種;AngⅡ組與AngⅡ+G1組組間差異蛋白36種。兩組間差異蛋白交叉存在的5種關鍵基因是Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1。與空白對照組相比,AngⅡ組的Rap1gap蛋白高表達(比值=1.348 98,P=0.033 99),而與AngⅡ組相比,AngⅡ+G 1組的Rap1gap蛋白表達又相對低表達(比值=0.743 79,P=0.017 02)。

    2.5 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與調控心肌細胞的信號通路(圖3)

    Western-blot結果顯示,與空白對照組或AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組p-AKT和p-ERK蛋白表達均有顯著升高(P<0.01)。AngⅡ+G1+G15組與AngⅡ+G1組相比,p-AKT和p-ERK蛋白表達降低(P均<0.05)。AngⅡ+G1+U0126組與 AngⅡ +G1組相比,p-ERK蛋白表達水平降低(P均<0.01),而p-AKT蛋白表達水平無變化(P>0.05);AngⅡ+G1+MK2206組與AngⅡ+G1組相比,其p-AKT和p-ERK蛋白表達水平均有明顯降低(P均<0.01)。

    圖3 蛋白免疫印跡法檢測6組心肌細胞絲氨酸/蘇氨酸激酶(3A)和細胞外調節(jié)蛋白激酶蛋白磷酸化(3B)水平的影響

    2.6 G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與緩解心肌細胞肥大可能主要與絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路有關(圖4)

    qRT-PCR結果顯示,與空白對照組比,AngⅡ組ANP和BNP mRNA水平均有顯著升高(P<0.01)。與AngⅡ組比,AngⅡ+G1組ANP和BNP mRNA水平均有明顯降低(P<0.01)。與 AngⅡ組或AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+MK2206組ANP和BNP mRNA水平均有明顯升高(P均<0.01)。

    2.7 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細胞凋亡和自噬的影響(圖5)

    流式細胞技術檢測結果顯示,空白對照組、AngⅡ組和AngⅡ+G1組的凋亡水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western-blot結果顯示,與空白對照組相比,AngⅡ組LC3II/LC3I增大(P<0.01);與AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組LC3II/LC3I減?。≒<0.01)。與AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+G15組心肌細胞LC3II/LC3I比值升高(P<0.01)。

    圖4 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑對心肌細胞心房鈉尿肽(4A)和B型利鈉肽信使核糖核酸(4B)水平的影響

    圖5 蛋白免疫印跡檢測激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細胞胞漿型自噬標記輕鏈3和膜型自噬標記輕鏈3表達的影響

    3 討論

    女性健康指南(WHI)隨機控制試驗和心臟雌激素重施(HERS)試驗均未得出雌激素對心血管系統(tǒng)保護作用的支持性結論,并且絕經期女性外源性雌激素替代治療可能增加女性生殖系統(tǒng)腫瘤[15],限制了臨床應用雌激素來保護心肌的相關研究的開展。新型膜雌激素受體GPER1的發(fā)現(xiàn)為雌激素抗心血管疾病的研究帶來了新的希望。本研究主要探討激活GPER1快速信號轉導途徑對心肌細胞的影響。本研究通過免疫熒光染色,Western-blot和qRT-PCR技術發(fā)現(xiàn),大鼠原代心肌細胞存在GPER1的表達,這與De Francesco等[16]的研究結果是相互印證的。

    緩解心肌細胞肥大是防止心臟肥厚進一步惡化的關鍵。ANP和BNP是重要的心臟神經內分泌激素,與心臟壓力負荷和容量負荷的增加有關,其mRNA水平是衡量心肌肥厚和心力衰竭的重要指標[17]。激活的GPER1能有效緩解心肌細胞肥大,該作用可被G15和MK2206阻斷。這就為雌激素替代療法提供了新的可能。單純激活GPER1既可以緩解細胞肥大,又相對之前的雌激素替代療法更加安全。

    生物信息學分析結果顯示Rap1gap蛋白分子下游的B-Raf/Raf-1-MEK-ERK信號通路、MAPK信號通路和PI3K-AKT信號通路參與GPER1介導的心肌細胞調控的關鍵信號通路。ERK信號通路與細胞的核轉錄作用有關,而AKT信號通路可能與心肌細胞的生長、肥大和存活相關。本研究Western-blot結果顯示,AKT和ERK參與GPER1介導的抗心肌細胞肥大作用,且MK2206(AKT特異性抑制劑)可同時抑制p-AKT和p-ERK蛋白表達。這就說明,PI3K-AKT信號通路和MEK-ERK信號通路可能存在交叉,AKT可能參與調控ERK的表達。

    哺乳動物的雷帕霉素靶(mTOR)作為AKT下游重要蛋白分子,是一種非典型AKT,可以影響基因轉錄與蛋白質翻譯,參與調控細胞生長、增殖等過程,與蛋白質合成、免疫、細胞運動及代謝、細胞凋亡及自噬等均有聯(lián)系[18]。相關實驗證實,雷帕霉素能抑制心肌細胞肥大,肥大過程中蛋白質合成的增加與AKT-mTOR信號通路的激活有關,雷帕霉素和PI3K抑制劑均能抑制肥大過程中蛋白質的合成[19]。細胞凋亡和自噬作為細胞維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制,都有可能參與心肌細胞肥大的調控。但本研究證實,GPER1介導的抗心肌細胞肥大作用可能與細胞凋亡無關,而與細胞自噬相關。GPER1受體可能通過PI3K-AKT-mTOR信號通路介導細胞自噬發(fā)揮抗心肌細胞肥大作用。然而,自噬與mTOR通路之間的關系非常復雜,而且GPER1的激活mTOR的具體機制,以及TORC1和mTORC2的相互調節(jié)作用仍需要進一步研究揭示。

    我們目前的研究尚處于起始階段,對GPER1生物功能的理解還不夠深入,隨著研究的深入,GPER1的潛在致癌作用(特別是婦科癌癥,如卵巢癌[20]和乳腺癌[21])和心血管保護功能將逐漸被揭示。

    參考文獻

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