• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的影響及其機制

    2018-05-21 08:34:34裴慧王立啟王磊王維畢秀萍才曉君蘇國海趙卓
    中國循環(huán)雜志 2018年5期
    關鍵詞:偶聯(lián)結果顯示空白對照

    裴慧,王立啟,王磊,王維,畢秀萍,才曉君,蘇國海,趙卓

    內源性雌激素對女性絕經前心血管內環(huán)境的穩(wěn)定起重要的調節(jié)作用[1],能延緩高血壓、心力衰竭和冠狀動脈疾病的發(fā)展。絕經后雌激素替代療法對心血管疾病具有保護作用[2,3]。最初研究證實,雌激素主要通過經典雌激素受體ERα和ERβ來調控基因的轉錄進而保護心血管系統(tǒng)[4,5]。隨著研究的深入,G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)作為雌激素受體的功能被發(fā)現(xiàn)[6],國際藥理學聯(lián)合會(IUPHAR)也將GPR30或G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPER1)分類為膜雌激素受體。

    GPER1參與雌激素介導的基因轉錄和信號通路的調節(jié)[7]。GPER1主要通過快速非基因組機制參與雌激素信號的傳導,如細胞應答效應中的鈣動員、激酶激活及一氧化氮產生等[8]。近年來,特異性GPER1激活劑G1(簡稱G1)[9]和抑制劑G15(簡稱G15)的合成,為其藥理學和生理學的研究開辟了新途徑。研究發(fā)現(xiàn),G1作用于內皮細胞、血管平滑肌細胞和腎素-血管緊張素系統(tǒng),產生舒張血管[10]、降低血壓[11]、抗炎[12]、防止心肌再灌注損傷[13]、緩解肺動脈高壓[14]等心血管保護作用。

    雖然GPER1具有潛在的心血管保護作用,但其在緩解心肌細胞肥大中的作用機制仍未闡明。本研究通過串聯(lián)質譜標簽(TMT)蛋白質譜技術和生物信息學分析進行大數(shù)據分析,通過蛋白免疫印跡法(Western-blot)和熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)技術探究其可能的調控機制。

    1 材料與方法

    材料與試劑: G1、G15(Cayman Chemical,美國),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國),胎牛血清(Gibico,美國)、馬血清(BI,以色列),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、抗GPER1抗體(Abcam,美國),抗絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抗體、抗p-AKT抗體、抗細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體、抗p-ERK抗體、抗LC3抗體和抗GAPDH抗體(CST,美國),二抗HRP(Proteintech,中國),Alexa Fluor 488抗體(Life Technologies,美國),4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DIPI,Thermo Fisher Scientific,美國),qRT-PCR試劑盒(TAKARA,日本)和流式試劑盒(BD,美國)。

    細胞培養(yǎng):2~3日齡的新生Wistar乳鼠50只(購自山東大學動物實驗中心)表皮消毒后,摘取心臟并剪碎成2~3 mm3的組織塊,胰蛋白酶(0.1%)重懸置于磁力攪拌器消化10 min。5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,800 g離心10 min后收集細胞。DMEM高糖培養(yǎng)基(含有6%馬血清、8%新生牛血清和1%青霉素/鏈霉素),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h。

    模型建立和分組:心肌細胞血清饑餓后,AngⅡ(0 、50 、100 和250 nmol/L)誘導心肌細胞肥大。檢測信號通路檢測實驗分為6組:空白對照組、AngⅡ 組、AngⅡ +G1組、AngⅡ +G1+G15組、AngⅡ+G1+ERK抑制劑 (U0126)組和AngⅡ+G1+AKT抑制劑 (MK2206)組??瞻讓φ战M不給藥;AngⅡ組給予AngⅡ(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1組給予AngⅡ(100 nmol/L)和G1(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1+G15組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和G15(100 nmol/L)處理;AngⅡ +G1+U0126組 給 予 AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L) 和 U0126(100 nmol/L) 處 理;AngⅡ+G1+MK2206組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和 MK2206(5 μmol/L)處理。各組n=3。

    蛋白質譜分析:檢測空白對照組、AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(100 nmol/L)組的蛋白表達差異。用軟件Mascot2.5和Proteome Discoverer2.1,篩選出差異倍數(shù)>1.2,P<0.05的差異蛋白分子。

    細胞免疫熒光染色:心肌細胞4%多聚甲醛固定20 min,0.5%Triton X-100細胞膜通透劑室溫通透20 min,血清封閉。GPER1抗體1:300稀釋4℃孵育過夜,PBST(PBS+Tween-20洗液,pH=7.4)浸洗后,熒光二抗避光孵育1 h,DAPI避光孵育10 min,鏡下觀察采集圖像。

    Western-blot: 6 孔板加入 100 μl RIPA 裂解液和1%PMSF蛋白酶抑制劑裂解細胞,超聲粉碎,4℃12 000 g離心,取上清蛋白定量。25 μl 5 X loading buffer 混勻后100℃水浴,-80℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,90 V恒壓電泳,250 mA恒流轉膜,5%脫脂奶粉封閉,洗膜,抗體1:1 000稀釋4℃孵育過夜。TBST洗液漂洗后,二抗1:1 0000孵育1 h,漂洗后化學發(fā)光法顯色。

    qRT-PCR檢測: Trizol法提取總RNA后,按Takara試劑盒說明書要求行cDNA逆轉錄。所有引物購自Takara公司,引物序列:心房鈉尿肽(ANP)上 游 引 物5'-CGTATACAGTGCGGTGTCCA-3',下 游 引 物 5'-GGTTGACTTCCCCAGTCCAG-3';B型 利 鈉 肽(BNP) 上 游 引 物5'-AGCTGCTGGAGCTGATAAGAG-3', 下 游 引 物5'-CTGCCCAAAGCAGCTTGAAC-3';GPER1 上 游 引物5'-CCATCATCGGCCTGTGCTAT-3',下游引物5'-GAAGACAAGGACCACTGCGA-3';GAPDH 上游引物5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

    統(tǒng)計學方法:數(shù)據采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進行分析。計量資料以±s表示,組間比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大

    Ang Ⅱ(0、50、100 和 250 nmol/L)誘導心肌細胞24 h。各組心肌細胞表面積分別為(1 343.6±202.9)μm2,(1 657.3±168.6)μm2,(2 603.1±381.7)μm2, (3 350.0±413.3)μm2。qRT-PCR檢測結果,與空白對照組相比,AngⅡ(100 nmol/L) 組的心肌細胞表面積明顯增大(P<0.01)。

    2.2 心肌細胞中存在G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達(圖 1)

    圖1 細胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應監(jiān)測心肌細胞G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達

    心肌細胞特異性免疫熒光(抗GPER1,綠光)染色結果顯示(圖1A),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1蛋白表達均較空白對照組明顯增加。Western-blot結果顯示(圖1B),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1蛋白表達水平均較空白對照組略有升高(P均<0.05),AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組對GPER1蛋白表達無差異(P>0.05)。qRT-PCR結果顯示(圖1C),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細胞GPER1 mRNA水平均較空白對照組均明顯升高(P均<0.05)。

    2.3 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1可以降低心肌細胞心房鈉尿肽和B型利鈉肽信使核糖核酸水平(圖2)

    GPER1激活劑G1(10、100和1 000 nmol/L)和AngⅡ(100 nmol/L)共同作用于心肌細胞。qRT-PCR結果顯示,與空白對照組相比,AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(10、100和1 000 nmol/L)組肥大心肌細胞ANP和BNP mRNA水平均明顯升高(P<0.01)。隨著G1濃度的升高,ANP和BNP mRNA水平基本呈梯度降低,尤其是AngⅡ+G1(100、1 000 nmol/L)組與AngⅡ(100 nmol/L)組相比ANP和BNP mRNA水平均明顯降低(P均<0.05)。

    圖2 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測濃度梯度G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1激活劑對心肌細胞心房鈉尿肽(2A) 和B型利鈉肽信使核糖核酸(2B)的影響

    2.4 各組乳鼠心肌細胞蛋白質質譜分析

    蛋白質譜分析顯示:空白對照組與AngⅡ組組間差異蛋白52種;AngⅡ組與AngⅡ+G1組組間差異蛋白36種。兩組間差異蛋白交叉存在的5種關鍵基因是Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1。與空白對照組相比,AngⅡ組的Rap1gap蛋白高表達(比值=1.348 98,P=0.033 99),而與AngⅡ組相比,AngⅡ+G 1組的Rap1gap蛋白表達又相對低表達(比值=0.743 79,P=0.017 02)。

    2.5 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與調控心肌細胞的信號通路(圖3)

    Western-blot結果顯示,與空白對照組或AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組p-AKT和p-ERK蛋白表達均有顯著升高(P<0.01)。AngⅡ+G1+G15組與AngⅡ+G1組相比,p-AKT和p-ERK蛋白表達降低(P均<0.05)。AngⅡ+G1+U0126組與 AngⅡ +G1組相比,p-ERK蛋白表達水平降低(P均<0.01),而p-AKT蛋白表達水平無變化(P>0.05);AngⅡ+G1+MK2206組與AngⅡ+G1組相比,其p-AKT和p-ERK蛋白表達水平均有明顯降低(P均<0.01)。

    圖3 蛋白免疫印跡法檢測6組心肌細胞絲氨酸/蘇氨酸激酶(3A)和細胞外調節(jié)蛋白激酶蛋白磷酸化(3B)水平的影響

    2.6 G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與緩解心肌細胞肥大可能主要與絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路有關(圖4)

    qRT-PCR結果顯示,與空白對照組比,AngⅡ組ANP和BNP mRNA水平均有顯著升高(P<0.01)。與AngⅡ組比,AngⅡ+G1組ANP和BNP mRNA水平均有明顯降低(P<0.01)。與 AngⅡ組或AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+MK2206組ANP和BNP mRNA水平均有明顯升高(P均<0.01)。

    2.7 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細胞凋亡和自噬的影響(圖5)

    流式細胞技術檢測結果顯示,空白對照組、AngⅡ組和AngⅡ+G1組的凋亡水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western-blot結果顯示,與空白對照組相比,AngⅡ組LC3II/LC3I增大(P<0.01);與AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組LC3II/LC3I減?。≒<0.01)。與AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+G15組心肌細胞LC3II/LC3I比值升高(P<0.01)。

    圖4 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑對心肌細胞心房鈉尿肽(4A)和B型利鈉肽信使核糖核酸(4B)水平的影響

    圖5 蛋白免疫印跡檢測激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細胞胞漿型自噬標記輕鏈3和膜型自噬標記輕鏈3表達的影響

    3 討論

    女性健康指南(WHI)隨機控制試驗和心臟雌激素重施(HERS)試驗均未得出雌激素對心血管系統(tǒng)保護作用的支持性結論,并且絕經期女性外源性雌激素替代治療可能增加女性生殖系統(tǒng)腫瘤[15],限制了臨床應用雌激素來保護心肌的相關研究的開展。新型膜雌激素受體GPER1的發(fā)現(xiàn)為雌激素抗心血管疾病的研究帶來了新的希望。本研究主要探討激活GPER1快速信號轉導途徑對心肌細胞的影響。本研究通過免疫熒光染色,Western-blot和qRT-PCR技術發(fā)現(xiàn),大鼠原代心肌細胞存在GPER1的表達,這與De Francesco等[16]的研究結果是相互印證的。

    緩解心肌細胞肥大是防止心臟肥厚進一步惡化的關鍵。ANP和BNP是重要的心臟神經內分泌激素,與心臟壓力負荷和容量負荷的增加有關,其mRNA水平是衡量心肌肥厚和心力衰竭的重要指標[17]。激活的GPER1能有效緩解心肌細胞肥大,該作用可被G15和MK2206阻斷。這就為雌激素替代療法提供了新的可能。單純激活GPER1既可以緩解細胞肥大,又相對之前的雌激素替代療法更加安全。

    生物信息學分析結果顯示Rap1gap蛋白分子下游的B-Raf/Raf-1-MEK-ERK信號通路、MAPK信號通路和PI3K-AKT信號通路參與GPER1介導的心肌細胞調控的關鍵信號通路。ERK信號通路與細胞的核轉錄作用有關,而AKT信號通路可能與心肌細胞的生長、肥大和存活相關。本研究Western-blot結果顯示,AKT和ERK參與GPER1介導的抗心肌細胞肥大作用,且MK2206(AKT特異性抑制劑)可同時抑制p-AKT和p-ERK蛋白表達。這就說明,PI3K-AKT信號通路和MEK-ERK信號通路可能存在交叉,AKT可能參與調控ERK的表達。

    哺乳動物的雷帕霉素靶(mTOR)作為AKT下游重要蛋白分子,是一種非典型AKT,可以影響基因轉錄與蛋白質翻譯,參與調控細胞生長、增殖等過程,與蛋白質合成、免疫、細胞運動及代謝、細胞凋亡及自噬等均有聯(lián)系[18]。相關實驗證實,雷帕霉素能抑制心肌細胞肥大,肥大過程中蛋白質合成的增加與AKT-mTOR信號通路的激活有關,雷帕霉素和PI3K抑制劑均能抑制肥大過程中蛋白質的合成[19]。細胞凋亡和自噬作為細胞維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制,都有可能參與心肌細胞肥大的調控。但本研究證實,GPER1介導的抗心肌細胞肥大作用可能與細胞凋亡無關,而與細胞自噬相關。GPER1受體可能通過PI3K-AKT-mTOR信號通路介導細胞自噬發(fā)揮抗心肌細胞肥大作用。然而,自噬與mTOR通路之間的關系非常復雜,而且GPER1的激活mTOR的具體機制,以及TORC1和mTORC2的相互調節(jié)作用仍需要進一步研究揭示。

    我們目前的研究尚處于起始階段,對GPER1生物功能的理解還不夠深入,隨著研究的深入,GPER1的潛在致癌作用(特別是婦科癌癥,如卵巢癌[20]和乳腺癌[21])和心血管保護功能將逐漸被揭示。

    參考文獻

    [1] Kearney PM, Whelton M, Reynolds K, et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data[J]. Lancet, 2005, 365(9455):217-223. DOI: 10. 1016/S0140-6736(05)17741-1.

    [2] 張冬, 竇克非. 絕經期前女性冠心病發(fā)病機制研究進展[J]. 中國循環(huán)雜志, 2012, 27(5): 397-398. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614.2012. 05. 023.

    [3] Baber RJ, Panay N, Fenton A, et al. 2016 IMS Recommendations on women's midlife health and menopause hormone therapy[J].Climacteric, 2016, 19(2): 109-150. DOI: 10. 3109/13697137. 2015.1129166.

    [4] Arias-loza PA, Jazbutyte V, Fritzemeier KH, et al. Functional effects and molecular mechanisms of subtype-selective ERalpha and ERbeta agonists in the cardiovascular system[J]. Ernst Schering Found Symp Proc, 2006, 16(1): 87-106. DOI: 10. 1007/2789. 2006. 018.

    [5] Heldring N, Pike A, Andersson S, et al. Estrogen receptors: how do they signal and what are their targets[J]. Physiol Rev, 2007, 87(3):905-931. DOI: 10. 1152/physrev. 00026. 2006.

    [6] Revankar CM, Cimino DF, Sklar LA, et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J].Science, 2005, 307(5715): 1625-1630. DOI: 10. 1126/science.1106943.

    [7] Meyer MR, Haas E, Prossnitz ER, et al. Non-genomic regulation of vascular cell function and growth by estrogen[J]. Mol Cell Endocrinol,2009, 308(1-2): 9-16. DOI: 10. 1016/j. mce. 2009. 03. 009.

    [8] Prossnitz ER, Arterburn JB, Smith HO, et al. Estrogen signaling through the transmembrane G protein-coupled receptor GPR30[J].Annu Rev Physiol, 2008, 70(1): 165-190. DOI: 10. 1146/annurev.physiol. 70. 113006. 100518.

    [9] Bologa CG, Revankar CM, Young SM, et al. Virtual and biomolecular screening converge on a selective agonist for GPR30[J]. Nat Chem Biol, 2006, 2(4): 207-212. DOI: 10. 1038/nchembio775.

    [10] Knowlton AA, Lee AR. Estrogen and the cardiovascular system[J].Pharmacol Ther, 2012, 135(1): 54-70. DOI: 10. 1016/j. pharmthera.2012. 03. 007.

    [11] Seok YM, Jang EJ, Reiser O, et al. 17beta-Estradiol induces vasorelaxation in a G-protein-coupled receptor 30-independent manner[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2012, 385(9):945-948. DOI: 10. 1007/s00210-012-0770-y.

    [12] Chakrabarti S, Davidge ST. G-protein coupled receptor 30 (GPR30): a novel regulator of endothelial inflammation[J]. PloS One, 2012, 7(12):e52357. DOI: 10. 1371/journal. pone. 0052357.

    [13] Lee TM, Lin SZ, Chang NC. Both GPER and membrane oestrogen receptor-alpha activation protect ventricular remodelling in 17beta oestradiol-treated ovariectomized infarcted rats[J]. J Cell Mol Med,2014, 18(12): 2454-2465. DOI: 10. 1111/jcmm. 12430.

    [14] 鄭泉, 鄧華君. 雌激素及其代謝產物與肺動脈高壓的相關性研究[J]. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30(2): 199-200. DOI: 10. 3969/j. issn.1000-3614. 2015. 02. 027.

    [15] Pardini D. Hormone replacement therapy in menopause[J]. Arq Bras Endocrinol Metabol, 2014, 58(2): 172-181. DOI: 10. 1590/0004-2730000003044.

    [16] De Francesco EM, Angelone T, Pasqua T, et al. GPER mediates cardiotropic effects in spontaneously hypertensive rat hearts [J]. PloS One, 2013, 8(8): e69322. DOI: 10. 1371/journal. pone. 0069322.

    [17] Maisel A. B-type natriuretic peptide levels: diagnostic and therapeutic potential[J]. Cardiovasc Toxicol, 2001, 1(2): 159-164. DOI: 10. 1385/CT: 1: 2: 159.

    [18] Lee CH, Inoki K, Guan KL. mTOR pathway as a target in tissue hypertrophy[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47(1): 443-467.DOI: 10. 1146/annurev. pharmtox. 47. 120505. 105359.

    [19] Hafizi S, Wang X, Chester AH, et al. AngⅡ activates effectors of mTOR via PI3-K signaling in human coronary smooth muscle cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004, 287(3): H1232-1238. DOI: 10.1152/ajpheart. 00040. 2004.

    [20] Ho SM. Estrogen, progesterone and epithelial ovarian cancer[J].Reprod Biol Endocrinol, 2003, 1(1): 73. DOI: 10. 1186/1477-7827-1-73.

    [21] Jiang QF, WU TT, Yang JY, et al. 17beta-estradiol promotes the invasion and migration of nuclear estrogen receptor-negative breast cancer cells through cross-talk between GPER1 and CXCR1[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2013, 138(292): 314-324. DOI:10. 1016/j.jsbmb. 2013. 07. 011.

    猜你喜歡
    偶聯(lián)結果顯示空白對照
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學中的應用
    解偶聯(lián)蛋白2在低氧性肺動脈高壓小鼠肺組織的動態(tài)表達
    最嚴象牙禁售令
    中國報道(2018年2期)2018-04-20 04:12:46
    過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    新聞眼
    金融博覽(2016年7期)2016-08-16 18:44:41
    第四次大熊貓調查結果顯示我國野生大熊貓保護取得新成效
    綠色中國(2016年1期)2016-06-05 09:02:59
    過渡金屬催化的碳-氮鍵偶聯(lián)反應的研究
    環(huán)氧樹脂偶聯(lián)納米顆粒制備超疏水表面
    中國塑料(2015年8期)2015-10-14 01:10:49
    8 種外源激素對當歸抽薹及產量的影響
    纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产淫片久久久久久久久| 最黄视频免费看| av卡一久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产高清国产精品国产三级 | 日日撸夜夜添| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲人成网站在线观看播放| 超碰97精品在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 大码成人一级视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 99国产精品免费福利视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 大片免费播放器 马上看| 国产精品欧美亚洲77777| 最黄视频免费看| 亚洲av中文av极速乱| 在线天堂最新版资源| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级毛片电影观看| 国产黄色免费在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 伦精品一区二区三区| 免费少妇av软件| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品日本国产第一区| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品一区二区在线不卡| 一级毛片 在线播放| av免费观看日本| 亚洲精品自拍成人| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久久久成人| 成年女人在线观看亚洲视频| 直男gayav资源| 超碰97精品在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产亚洲精品久久久com| 国精品久久久久久国模美| 黑人猛操日本美女一级片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品熟女少妇av免费看| 伦理电影大哥的女人| 尾随美女入室| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 老女人水多毛片| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 黄色日韩在线| 欧美97在线视频| 国产视频内射| 精品一区二区三区视频在线| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| .国产精品久久| 丝袜喷水一区| 国产 精品1| 国产在视频线精品| 久久韩国三级中文字幕| 在线观看国产h片| 一边亲一边摸免费视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黄色配什么色好看| 高清视频免费观看一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 伊人久久国产一区二区| 晚上一个人看的免费电影| 人妻系列 视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲精品一区蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 热99国产精品久久久久久7| 最近手机中文字幕大全| 成人无遮挡网站| 在线观看免费高清a一片| 色视频在线一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久视频综合| 久久久久久久久大av| 精品一区二区免费观看| 亚洲怡红院男人天堂| 看非洲黑人一级黄片| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品成人在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日韩av不卡免费在线播放| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人精品久久久久久| 日本免费在线观看一区| h日本视频在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美一级a爱片免费观看看| av在线老鸭窝| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品福利在线免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 九九在线视频观看精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 女人久久www免费人成看片| 久久久久国产网址| 在线播放无遮挡| 国产伦在线观看视频一区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 97在线人人人人妻| 老熟女久久久| 内地一区二区视频在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品亚洲成a人片在线观看 | 日本午夜av视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩中字成人| 少妇被粗大猛烈的视频| 最新中文字幕久久久久| www.色视频.com| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲国产欧美人成| 国产永久视频网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 新久久久久国产一级毛片| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩电影二区| 18+在线观看网站| 亚洲久久久国产精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人亚洲精品一区在线观看 | 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲国产欧美在线一区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| av一本久久久久| 久久久久久久精品精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 婷婷色综合www| 久久久久精品性色| 国产乱来视频区| 中文字幕制服av| 在线观看人妻少妇| 亚洲三级黄色毛片| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产人妻一区二区三区在| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 美女福利国产在线 | 中文在线观看免费www的网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜免费男女啪啪视频观看| 身体一侧抽搐| 亚洲精品自拍成人| av免费观看日本| 七月丁香在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 青青草视频在线视频观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲四区av| a级毛色黄片| 欧美成人午夜免费资源| 成人美女网站在线观看视频| 欧美高清成人免费视频www| 免费大片黄手机在线观看| 全区人妻精品视频| 久久久亚洲精品成人影院| 永久免费av网站大全| 日韩欧美 国产精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 91久久精品电影网| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品偷伦视频观看了| 草草在线视频免费看| 最近最新中文字幕免费大全7| 一本色道久久久久久精品综合| 国产一区亚洲一区在线观看| 高清av免费在线| 夫妻午夜视频| 搡老乐熟女国产| 观看美女的网站| 国产中年淑女户外野战色| 妹子高潮喷水视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 2021少妇久久久久久久久久久| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲四区av| 亚洲人与动物交配视频| 美女高潮的动态| 亚洲av不卡在线观看| 成年av动漫网址| 免费黄频网站在线观看国产| 男女无遮挡免费网站观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产成人a区在线观看| 国产成人a区在线观看| 国产av一区二区精品久久 | av福利片在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久国产乱子免费精品| 少妇人妻 视频| 亚州av有码| 激情五月婷婷亚洲| 91久久精品国产一区二区成人| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 五月天丁香电影| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕免费在线视频6| 丝袜喷水一区| 少妇的逼水好多| 日韩国内少妇激情av| 老司机影院毛片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品偷伦视频观看了| 成人国产麻豆网| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产黄片视频在线免费观看| 插阴视频在线观看视频| 国产美女午夜福利| 欧美成人精品欧美一级黄| 少妇精品久久久久久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 国产高潮美女av| 国产一区二区三区av在线| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 婷婷色综合www| 99热这里只有是精品在线观看| 国产在线一区二区三区精| 久久婷婷青草| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美三级亚洲精品| 国产精品偷伦视频观看了| 色婷婷av一区二区三区视频| av一本久久久久| 嫩草影院入口| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产黄色免费在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中国国产av一级| 99热这里只有精品一区| 日韩欧美 国产精品| 天美传媒精品一区二区| 观看免费一级毛片| 男的添女的下面高潮视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲综合精品二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 永久网站在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美成人午夜免费资源| 永久网站在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久99热6这里只有精品| 黄色一级大片看看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色哟哟·www| 一级av片app| 伦理电影大哥的女人| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产欧美人成| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产伦在线观看视频一区| 免费高清在线观看视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 日日啪夜夜爽| 久久久久久九九精品二区国产| 精品少妇久久久久久888优播| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品亚洲一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 少妇熟女欧美另类| 亚洲精品一二三| 欧美bdsm另类| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲图色成人| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产欧美人成| 国产精品久久久久成人av| 欧美日本视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲图色成人| 亚洲一区二区三区欧美精品| 美女福利国产在线 | 亚洲av二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产亚洲91精品色在线| 久久人人爽人人片av| 五月开心婷婷网| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品第二区| 国产有黄有色有爽视频| 嫩草影院新地址| 国产伦精品一区二区三区四那| freevideosex欧美| 在线观看免费高清a一片| 在线观看免费视频网站a站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 五月开心婷婷网| 国产精品一区二区在线不卡| av黄色大香蕉| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 如何舔出高潮| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av视频免费观看在线观看| av网站免费在线观看视频| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品蜜桃在线观看| 大香蕉久久网| 国产成人精品婷婷| 直男gayav资源| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av不卡在线播放| www.av在线官网国产| 国产男人的电影天堂91| 如何舔出高潮| 国产免费福利视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品国产av在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av综合色区一区| 在线观看av片永久免费下载| 能在线免费看毛片的网站| 久久久久久久久久成人| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产久久久一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一区二区三区四区激情视频| 又爽又黄a免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 99热国产这里只有精品6| 国内精品宾馆在线| 国产成人a区在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 麻豆国产97在线/欧美| 国产深夜福利视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产亚洲最大av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | av一本久久久久| 丝袜脚勾引网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久性生活片| 制服丝袜香蕉在线| 91久久精品国产一区二区成人| 成人一区二区视频在线观看| 观看av在线不卡| 国模一区二区三区四区视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 永久免费av网站大全| 成人特级av手机在线观看| 美女高潮的动态| 国产av精品麻豆| 午夜免费鲁丝| 精品亚洲成a人片在线观看 | 一级毛片久久久久久久久女| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久午夜欧美精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 老司机影院毛片| 少妇的逼好多水| 伊人久久国产一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 高清欧美精品videossex| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产成人精品福利久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 97热精品久久久久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 十分钟在线观看高清视频www | 久久久久性生活片| 22中文网久久字幕| 91精品伊人久久大香线蕉| av视频免费观看在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧美日韩东京热| 男女国产视频网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产深夜福利视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜激情福利司机影院| 黄色配什么色好看| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产在线男女| 日韩伦理黄色片| 国产视频内射| 22中文网久久字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 新久久久久国产一级毛片| av播播在线观看一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 中文在线观看免费www的网站| 日韩欧美 国产精品| 偷拍熟女少妇极品色| 国产爽快片一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品国产成人久久av| 91精品国产九色| 高清毛片免费看| h日本视频在线播放| 亚洲av福利一区| 99热6这里只有精品| 国产成人精品福利久久| 久久久久视频综合| 麻豆乱淫一区二区| 大香蕉久久网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 秋霞在线观看毛片| 色综合色国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产人妻一区二区三区在| 在线精品无人区一区二区三 | 免费看日本二区| 高清午夜精品一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 欧美高清性xxxxhd video| 在线看a的网站| 超碰av人人做人人爽久久| 又爽又黄a免费视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久6这里有精品| 国产成人a区在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 另类亚洲欧美激情| 精品久久久久久电影网| 国产成人aa在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品三级大全| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产视频首页在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美zozozo另类| 国产淫语在线视频| 在线观看一区二区三区| a 毛片基地| av天堂中文字幕网| 成人特级av手机在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 午夜福利在线在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 欧美最新免费一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最后的刺客免费高清国语| 久久av网站| 午夜激情久久久久久久| 亚洲人成网站在线播| 男人舔奶头视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 伦精品一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产爽快片一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 免费观看的影片在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 久久影院123| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品精品国产色婷婷| 美女中出高潮动态图| 久久久成人免费电影| 香蕉精品网在线| 黄片wwwwww| 中文在线观看免费www的网站| 高清av免费在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 偷拍熟女少妇极品色| 大香蕉久久网| 久久99热这里只频精品6学生| 久久精品国产亚洲av涩爱| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 日韩亚洲欧美综合| 国产爱豆传媒在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 大话2 男鬼变身卡| 男男h啪啪无遮挡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日日啪夜夜撸| 毛片女人毛片| 一个人看视频在线观看www免费| 成人国产av品久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩av免费高清视频| 国产乱人偷精品视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产黄色免费在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品久久久久久久末码| 五月开心婷婷网| 色视频在线一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 777米奇影视久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费看av在线观看网站| 2022亚洲国产成人精品| 乱系列少妇在线播放| 男女免费视频国产| 亚洲欧美清纯卡通| 国产男女超爽视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 成人亚洲精品一区在线观看 | 三级国产精品片| 日韩av不卡免费在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线天堂最新版资源| 国产免费一区二区三区四区乱码| 天堂中文最新版在线下载| 日韩 亚洲 欧美在线| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲国产色片| av网站免费在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 一区二区三区精品91| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲熟女精品中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 在线观看一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 少妇的逼好多水| 久久这里有精品视频免费| 一级a做视频免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 97在线视频观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产高清有码在线观看视频| 欧美日韩综合久久久久久| 日本一二三区视频观看| 黄色日韩在线| 久久久久精品性色| 高清视频免费观看一区二区| 91精品国产国语对白视频| 熟女电影av网| 最近的中文字幕免费完整| 人体艺术视频欧美日本| 插阴视频在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产有黄有色有爽视频| av不卡在线播放| 两个人的视频大全免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品第二区| 亚洲欧美精品专区久久| 嘟嘟电影网在线观看|