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    全外顯子組測序證實家族性肺動脈高壓骨形成蛋白受體2基因新突變的研究

    2018-05-21 08:34:33鄭亞國林松張航謝渡江周陵陳紹良
    中國循環(huán)雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:家系外顯子基因突變

    鄭亞國,林松,張航,謝渡江,周陵,陳紹良

    肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種以肺動脈內(nèi)膜增生、中膜肥厚及叢樣病變?yōu)樘卣鞯囊环N疾病[1]。PAH的發(fā)病機制與遺傳因素密切相關(guān),目前指南把可遺傳性PAH單獨列為PAH的1個亞型。已知骨形成蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2, BMPR2)、活化素受體 類 激 酶 1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)、Smad蛋 白 9(SMAD9)、 小 窩 蛋 白 l(caveolin-1,CAV-l)和鉀離子通道蛋白3(KCNK3)等多種基因突變和PAH發(fā)病有關(guān)[2]。目前研究發(fā)現(xiàn),BMPR2是目前已知的最主要的PAH致病基因,約70%的可遺傳性PAH及26%的特發(fā)性PAH患者存在BMPR2基因突變,公共數(shù)據(jù)庫ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)共計報道了超過500個BMPR2的不同突變位點[3-5]。本研究中,我們利用全外顯子組測序方法對一個PAH家系進行研究,以發(fā)現(xiàn)BMPR2基因的突變位點。

    1 資料與方法

    研究對象:收集2016-11來本院就診的一個中國漢族PAH家系的資料, 3代共8人,所有成員均為江蘇籍漢族人,有2位已確診為PAH,其中男性1例(先證者),女性1例,為母子關(guān)系(圖1)。另選擇100名健康志愿者作為正常對照。PAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2015年歐洲心臟病學(xué)會PAH診治指南[1]。對所有家系成員進行病史采集、體格檢查、心電圖及超聲心動圖檢查,同時對先證者及超聲心動圖懷疑PAH的家系成員進行生化、免疫學(xué)檢查、六分鐘步行距離及右心導(dǎo)管檢查等更為詳盡的臨床評估。所有入選家系成員和健康志愿者均簽署知情同意書。

    圖1 該肺動脈高壓家系圖

    標(biāo)本采集及DNA提?。哼x用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管分別收集本研究家系8名成員的外周靜脈血5 ml。按照DNA提取試劑盒(Qiagen, 德國)說明書提取基因組DNA。采用紫外分光光度法測定提取DNA的濃度與純度,-20℃分裝保存。

    全外顯子組測序:先證者及其母親與先證者的父親及姨媽(正常者)作對照,進行外顯子測序分析(諾禾致源,北京)。將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180~280 bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。帶有特異index的文庫pooling后與生物素標(biāo)記的探針進行液相雜交,再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)線性擴增后進行文庫質(zhì)檢,合格即可運用Illumina平臺進行測序。

    生物信息學(xué)分析:獲得原始測序序列后,在有參考序列或參考基因組(GRCh37/hg19)的情況下,進行信息分析流程,大致包括以下三個部分:測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估,變異檢測,變異篩選及與疾病相關(guān)性的預(yù)測。同時,對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控檢測,包括測序深度、覆蓋度均一性等分析。序列比對使用Burrows-Wheeler Aligner 軟件。在比對結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們利用SAMtools識別SNP和InDel位點,并采用國際慣用的過濾標(biāo)準(zhǔn)對這些位點進行過濾。測序結(jié)果經(jīng)公共遺傳數(shù)據(jù)庫dbSNP138及千人基因數(shù)據(jù)庫過濾,去掉公共人群單核苷酸多態(tài)性突變和同義突變。剩余的突變根據(jù)ACMG開發(fā)的針對序列變異解讀的標(biāo)準(zhǔn)和指南對突變位點有害性進行分類,留取致病性的變異位點及可能致病性的變異位點進行分析。再取2例患者突變的交集。

    致病基因家系樣本測序驗證:將數(shù)據(jù)分析后得到的可能的致病基因BMPR2的突變位點,設(shè)計引物,在其余4個家系成員及100名健康志愿者中進行Sanger測序驗證。采用Primer 5軟件設(shè)計引物,用PCR技術(shù)擴增BMPR2基因的6號外顯子,引物由上海生工公司合成,引物序列為:BMPR2-EX6F:AAACACTTGCAGCTGATTGG;BMPR2-EX6R:TTACATTGGGATAGTACTCCATCAC。DNA樣 本經(jīng)PCR擴增后在自動測序儀ABI 3730XL Genetic Analyzer(賽墨飛,美國)上進行測序。

    2 結(jié)果

    臨床資料:先證者為14歲男性,因為活動后胸悶、氣喘先后在三家醫(yī)院就診,查體發(fā)現(xiàn)肺動脈第二心音亢進,心電圖示電軸右偏,肺性P波,右心室重度肥厚,超聲心動圖示右心房、右心室擴大,右心室壁增厚,室間隔左移,左心室呈“D”型,估測肺動脈收縮壓91 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);右心導(dǎo)管測量右心房壓11 mmHg,肺動脈收縮壓/舒張壓119/56 mmHg,肺動脈平均壓77 mmHg,肺毛細血管鍥壓11 mmHg,心輸出量4.92 L/min,肺小動脈阻力13.4 Wood units,急性肺血管擴張試驗陰性,確診PAH后先后給予波生坦(125 mg,bid)、他達拉非(10 mg,qd)及貝前列素鈉片(60 μg,tid)治療。另一位確診的PAH患者為先證者母親,38歲,活動后胸悶、氣喘10年,目前活動耐力重度受限,心電圖示頻發(fā)室性早搏,電軸右偏,肺性P波,右心室重度肥厚,超聲心動圖示右心房、右心室擴大,估測肺動脈收縮壓132 mmHg,隨訪至2017-03,患者母親死于右心衰竭。

    全基因組外顯子測序結(jié)果:家系中2例患者(Ⅱ2,Ⅲ1)及兩名正常者(Ⅱ1,Ⅱ3)的外顯子測序結(jié)果見表1。我們在2例患者的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了23 302及23 021個SNPs位點及629和582個編碼Indels。我們重點關(guān)注非同義突變位點、變異性剪接位點、插人和缺失的移碼突變位點,并排除在dbSNPl38數(shù)據(jù)庫及1 000 Genome Project數(shù)據(jù)庫中存在的突變位點。同時我們?nèi)?例患者的交集,經(jīng)過一系列篩選后剩下127個突變位點,包括114個SNPs和13個Indels。我們根據(jù)得到的結(jié)果,與已報道的遺傳學(xué)PAH相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中比對,發(fā)現(xiàn)在此家系中發(fā)現(xiàn)BMPR2基因6號外顯子747位點的移碼突變(BMPR2:NM_001204:e xon6:c.747_748insCCTTTGATGGAACATGA:p.V250fs)在2例PAH患者中均存在,在2名對照者中均不存在,很可能是該家系的致病基因。家系中的2例患者并不攜帶其他已知的與PAH相關(guān)的致病基因,如 CAV-1、ALK1、KCNK3、SMAD9、BMPR1B、ENG、MADH9及PPHR等。

    BMPR2突變位點家系驗證及擴大樣本驗證:為了確定BMPR2移碼突變(hg19 chr2: g.203383670G>GCCTTTGATGGAACATGA)是該家系的致病基因,我們設(shè)計了針對該突變位點的引物。并用Sanger測序法對該家系8個成員的DNA樣本進行測序驗證。測序結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對分析,發(fā)現(xiàn)2例患者均攜帶有BMPR2插入雜合突變,而家族其余成員均沒有該位點插入或缺失突變(圖2)。BMPR2插入雜合突變(c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA)在該家系中表現(xiàn)出與臨床表型的完全共分離。

    表1 外顯子測序數(shù)據(jù)

    圖2 骨形成蛋白受體2基因突變位點DNA序列圖

    我們進一步在100名健康志愿者樣本中進行驗證,未發(fā)現(xiàn)有BMPR2基因6號外顯子747位點的插入雜合突變。通過CADD軟件分析,該突變致BMPR2的250~256位氨基酸發(fā)生移碼突變(p.V250fs),并自257位終止;插入突變破壞了讀碼框,翻譯截短蛋白,從而造成BMPR2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能缺陷。因此,BMPR2基因6號外顯子747位點的插入雜合突變(c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA)是造成該家系患者肺動脈高壓的遺傳學(xué)病因。

    3 討論

    目前認為BMPR2基因突變引起B(yǎng)MPR2的功能缺陷是PAH的重要發(fā)病機制。BMPR2基因突變與PAH患者的臨床表型及預(yù)后密切相關(guān)。攜帶BMPR2基因突變的患者臨床表型更為嚴(yán)重,發(fā)病時間更早,血液動力學(xué)改變更嚴(yán)重,急性肺血管擴張試驗的陽性率更低,預(yù)后更差[6,7]。

    在本研究中,我們利用高通量的二代測序技術(shù)對患者樣本進行全外顯子組測序。全外顯子測序利用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)將基因組的全部外顯子區(qū)域DNA捕獲后進行高通量測序,不僅能快速發(fā)現(xiàn)罕見遺傳病的致病基因,也能用于多基因引起的常見疾病,從而揭示這些疾病的遺傳致病機理。目前全外顯子測序用于肺動脈高壓的研究發(fā)現(xiàn)許多和肺動脈高壓發(fā)病有關(guān)的新基因[8-10]。本研究中,我們在一個中國漢族PAH家系中發(fā)現(xiàn)了BMPR2基因6號外顯子747位點新的插入雜合突變位點(c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA)。目前6號外顯子上的已經(jīng)報道的和肺動脈高壓相關(guān)的突變包括無義突變(c.631C>T)、錯義突變(c.604A>T、c.794A>G、c.797G>C 及 c.806G>T)、剪接突變(c.852+1G>C、c.853-1G>C) 及 移 碼 突 變(c.612delA、c.690-691delAGinsT 及 c.673-679delCGTCCAG)[4,5]。

    在此家系中,我們認為,BMPR2基因插入雜合突變(c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA)導(dǎo)致PAH表型,主要基于以下證據(jù):(1)該突變經(jīng)過外顯子測序發(fā)現(xiàn)同時經(jīng)過Sanger測序驗證,并且在100名健康志愿者和dbSNP l38、千人基因數(shù)據(jù)庫中都未發(fā)現(xiàn)有該突變;(2)該突變在本家系中表現(xiàn)出明顯的遺傳共分離現(xiàn)象,呈現(xiàn)常染色顯性遺傳特征,攜帶BMPR2基因突變的PAH患者是雜合子,等位基因中有一個是突變型,另一個是野生型;這與文獻報道的PAH遺傳特性一致;(3)BMPR2基因是一個目前公認的PAH發(fā)病相關(guān)的基因,該突變位點附近的很多突變位點已經(jīng)被相關(guān)文獻報道[4,5]。(4)BMPR2突變致BMPR2 250位纈氨酸后發(fā)生移碼突變(p.V250fs),插入突變破壞了讀碼框,翻譯截短蛋白,從而造成BMPR2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能缺陷。因此,我們認為該突變導(dǎo)致了PAH的發(fā)生。

    該研究對于有家族史的患者,未常規(guī)使用一代測序排查常見致病基因突變,直接使用二代測序,最終發(fā)現(xiàn)的還是BMPR2基因上的突變,在一定程度上增加了科研經(jīng)費支出。本研究報道了一個中國漢族人PAH家系,通過全外顯子組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了BMPR2基因的一個新的移碼突變位點(c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA)。該位點在該家系中表現(xiàn)出共性分離,是該家系PAH發(fā)生的遺傳學(xué)病因。本研究豐富了BMPR2基因的致病突變位點譜。

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