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    上調(diào)miR-19b表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷影響及機制

    2021-04-12 00:00:00代曉曉鞠波

    [摘要]目的探討上調(diào)miR-19b表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響及機制。方法體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,將其分為對照組、H2O2組、H2O2+miR-NC組和H2O2+miR-19b組,采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組細(xì)胞中miR-19b表達(dá),四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法和流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞存活率和凋亡率,相關(guān)試劑盒檢測細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)水平,蛋白印跡(Western blot)檢測各組細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)等蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組相比,H2O2組細(xì)胞中miR-19b表達(dá)、細(xì)胞存活率和細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平均降低(P均lt;0.05),而細(xì)胞凋亡率、LDH活力和MDA含量均升高(P均lt;0.05)。與H2O2組相比較,H2O2+miR-19b組miR-19b表達(dá)、細(xì)胞存活率和細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力以及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平均升高(P均lt;0.05),而細(xì)胞凋亡率、LDH活力和MDA含量均降低(P均lt;0.05)。結(jié)論上調(diào)miR-19b表達(dá)可提高H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞存活率,減輕細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷,其作用機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]miR-19b;神經(jīng)細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;PI3K/AKT信號通路

    [中圖分類號]R322.8;R342.2[文獻標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532(2021)01-0082-05

    [ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-19b upregulation on H2O2-induced SH-SY5Y cell injury and rela-ted mechanism. MethodsSH-SY5Y cells were cultured in vitro and were then divided into control group, H2O2 group, H2O2+miR-NC group, and H2O2+miR-19b group. RT-PCR was used to measure the expression of miR-19b in each group; MTT assay and flow cytometry were used to measure cell viability and apoptosis rate, respectively; related kits were used to measure the level of lactate dehydrogenase (LDH) in cell supernatant and the levels of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), and glutathione peroxidase (GSH-Px) in cells; Western blot was used to measure the protein expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), protein kinase B (AKT), and phosphorylated AKT (p-AKT). ResultsCompared with the control group, the H2O2 group had significant reductions in the expression of miR-19b in cells, cell viability, the activities of SOD and GSH-Px in cells, and the protein expression levels of PI3K and p-AKT (all Plt;0.05), as well as significant increases in cell apoptosis rate, LDH activity, and MDA content (all Plt;0.05). Compared with the H2O2 group, the H2O2+miR-19b group had significant increases in the expression of miR-19b, cell viability, the activities of SOD and GSH-Px, and the protein expression levels of PI3K and p-AKT (all Plt;0.05), as well as significant reductions in cell apoptosis rate, LDH activity, and MDA content (all Plt;0.05). ConclusionUpregulation of miR-19b can increase the viability of H2O2-induced SH-SY5Y cells and reduce cell apoptosis and oxidative stress injury, possibly by activating the PI3K/AKT signaling pathway.

    [KEY WORDS]miR-19b; nerve cells; apoptosis; oxidative stress; PI3K/AKT signaling pathway

    阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重威脅人類生命健康,給病人家庭及社會造成了巨大的經(jīng)濟壓力。研究顯示,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2],減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷對于神經(jīng)退行性疾病的治療尤為重要。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等生理或病理過程,在人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3-5]。MiR-19b是miR-17-92基因簇家族成員,在改善氧化應(yīng)激所致的心肌損傷、肺損傷等方面發(fā)揮積極作用[6-7]。過氧化氫(H2O2)是細(xì)胞氧化代謝的重要產(chǎn)物,可以穿透細(xì)胞膜與胞內(nèi)還原型鐵離子反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,能夠造成多種組織細(xì)胞損傷,常用于建立細(xì)胞損傷模型[8-9]。有文獻報道,miR-19b在阿爾茨海默病病人血清中表達(dá)下調(diào),而上調(diào)其表達(dá)可改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能[10]。但目前,miR-19b是否在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護作用尚不清楚。因此,本研究主要觀察了上調(diào)miR-19b表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y損傷的影響,并探討其可能的分子機制,旨在為改善H2O2所致神經(jīng)損傷提供新靶點。

    1材料與方法

    1.1主要試劑

    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株購于上海銳聰實驗設(shè)備有限公司,乳酸脫氫酶(LDH)和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)試劑盒購于南京建成科技有限公司,1640培養(yǎng)液、胎牛血清和2.5 g/L胰蛋白酶購于美國Gibco公司,辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠或兔IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于美國Santa Cruz公司,四甲基噻唑藍(lán)(MTT)試劑購于美國Sigma公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000以及總RNA提取試劑(Trizol試劑)購于美國Invitrogen公司。miR-19b引物序列、miR-19b模擬物及其陰性對照購于廣州銳博生物公司。實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒購于大連寶生物公司。

    1.2實驗方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組處理采用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37 ℃、飽和濕度和體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞。將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞種植于細(xì)胞板上,常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)75%時,參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-19b模擬物及其對照序列分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞。將細(xì)胞分為如下4組:①對照組(A組):SH-SY5Y細(xì)胞未處理,常規(guī)培養(yǎng)24 h;②H2O2組(B組):200 μmol/L的H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h;③H2O2+miR-NC組(C組):200 μmol/L的H2O2處理轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物對照序列的SH-SY5Y細(xì)胞24 h;④H2O2+miR-19b組(D組):200 μmol/L的H2O2處理轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物的SH-SY5Y細(xì)胞24 h。

    1.2.2RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)以2.5 g/L胰蛋白酶消化收集處理4組細(xì)胞后,采用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA后,使用紫外線分光光度計檢測RNA的濃度與純度。參照RT-PCR試劑盒說明書步驟將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,并以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,使用廣州銳博生物公司合成的PCR引物上PCR儀進行擴增。PCR引物及其序列見表1。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性6 min;95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參照,采用2-△△Ct法檢測各組細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

    1.2.3MTT法檢測細(xì)胞存活率將細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板上,按照1.2.1進行分組處理。每組實驗設(shè)置5個復(fù)孔。處理結(jié)束后,棄上清液,加入5 g/L的 MTT溶液,于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。加二甲基亞砜溶液震蕩反應(yīng)15 min后,用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度值(A),并計算各組細(xì)胞的存活率。存活率(%)=(實驗值A(chǔ)/對照組A)×100%。實驗重復(fù)3次。

    1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上,按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后,用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞。以磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞2次后,加入500 μL的 Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再加入Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μL,重復(fù)混勻后置于避光條件下反應(yīng)15 min,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

    1.2.5MDA含量和LDH、SOD、GSH-Px活力檢測將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上,按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞及上清液,分別參照LDH、SOD、MDA和GSH-Px試劑盒說明書步驟進行檢測。實驗重復(fù)3次。

    1.2.6Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT和p-AKT蛋白的表達(dá)將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上,按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白后,參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與等體積的Loading buffer充分混勻后,置于沸水浴中煮沸變性5 min。將蛋白樣品以每孔80 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離,分離結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜置于含有50 g/L脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h后,轉(zhuǎn)入以1∶1 000比例稀釋的一抗工作液中于室溫下孵育2 h;封閉液洗膜后,然后轉(zhuǎn)入以1∶2 000比例稀釋的二抗工作液中室溫孵育1.5 h。滴加化學(xué)發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影曝光后,采用凝膠成像系統(tǒng)分別掃描分析各組細(xì)胞中PI3K、AKT和p-AKT等蛋白的表達(dá)水平。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量數(shù)據(jù)以±s形式表示,多組間比較使用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細(xì)胞miR-19b表達(dá)變化

    各組間miR-19b的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=148.58,Plt;0.001)。多重比較結(jié)果顯示:與對照組相比較,H2O2組SH-SY5Y細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)水平明顯降低(Plt;0.05);與H2O2組相比,H2O2+miR-19b組細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)水平明顯升高(Plt;0.05)。見表2。

    2.2上調(diào)miR-19b表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞存活率和凋亡率的影響

    各組間細(xì)胞存活率、凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=185.84、60.69,P均lt;0.001)。多重比較結(jié)果顯示:與對照組相比較,H2O2組細(xì)胞存活率明顯降低(Plt;0.05),而凋亡率明顯升高(Plt;0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;與H2O2組相比較, H2O2+miR-19b組細(xì)胞存活率明顯升高(Plt;0.05),而細(xì)胞凋亡率明顯降低(Plt;0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

    2.3上調(diào)miR-19b表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞MDA含量和SOD、GSH-Px、LDH活力影響

    各組間MDA、SOD、GSH-Px和LDH差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=128.069~288.945,P均lt;0.05)。多重比較結(jié)果顯示:與對照組相比,H2O2組細(xì)胞上清液中LDH活力和細(xì)胞內(nèi)MDA含量均升高(Plt;0.05),而細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活力降低(Plt;0.05);與H2O2組相比,H2O2+miR-19b組中LDH活力和MDA含量均降低(Plt;0.05),而SOD和GSH-Px活力升高(Plt;0.05)。上述各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

    2.4上調(diào)miR-19b表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    各組間PI3K、p-AKT和AKT差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.349~204.192,P均lt;0.05)。多重比較結(jié)果顯示:與對照組相比較,H2O2組細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(Plt;0.05);與H2O2組相比,H2O2+miR-19b組細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(Plt;0.05)。見圖2、表4。

    3討論

    H2O2可產(chǎn)生活性氧,增強細(xì)胞膜的通透性,促進細(xì)胞色素C釋放,進而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[11-13]。LDH是一種反映細(xì)胞損傷的糖酵解酶,其釋放量越高,細(xì)胞損傷程度越重[14]。SOD是體內(nèi)重要的氧自由基天然清除劑,可減輕自由基對機體組織造成的損傷[15]。GSH-Px也是一種重要的抗氧化酶,且與SOD具有協(xié)同作用[16]。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物之一,其含量高低可間接反映自由基對機體的損傷程度[17]。本文的研究結(jié)果顯示,200 μmol/L的H2O2處理降低了神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的存活率,提高了細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞上清液中LDH活力和細(xì)胞內(nèi)MDA的含量,而降低了細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活力,表明H2O2誘導(dǎo)了SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷。

    miRNA在真核生物中廣泛存在,參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。作為一種miRNA,miR-19b參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進程。研究顯示,miR-19b在失血性休克病人中升高,下調(diào)miR-19b可減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,降低肺損傷[18]。上調(diào)miR-19b和miR-21可通過靶向下調(diào)PTEN的表達(dá)來抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,減輕脊髓損傷[19]。而減少miR-19b的表達(dá)可以改善艾塞那肽對非肥胖糖尿病的治療作用,有效控制血糖并改善炎癥反應(yīng)和免疫功能,并減少胰島細(xì)胞損傷[20]。miR-19b在小鼠哮喘模型中低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可通過升高SOD活力和降低MDA含量減輕氧化應(yīng)激引起的肺組織損傷[7]。本研究以H2O2處理SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞結(jié)果顯示,細(xì)胞中miR-19b表達(dá)水平明顯降低,提示miR-19b可能在H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。通過轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物成功上調(diào)miR-19b表達(dá),而且上調(diào)miR-19b表達(dá)提高了H2O2作用下的SH-SY5Y細(xì)胞存活率,并降低了細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞上清中LDH活力和細(xì)胞中MDA含量,且提高了SOD和GSH-Px的活力。提示上調(diào)miR-19b表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激水平,減輕了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。這與WEI等[21]報道的miR-19b可減輕MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的結(jié)果一致。

    PI3K/AKT信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一,AKT在PI3K信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著樞紐作用,其磷酸化被激活后可通過調(diào)控多種基因的表達(dá)在細(xì)胞代謝、增殖和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用,與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-23]。已有研究結(jié)果顯示,在H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷過程中PI3K/AKT信號通路受到抑制[24];miR-19b可能通過下調(diào)PTEN表達(dá)激活A(yù)KT信號通路[25]。為了探討miR-19b在保護H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的分子機制,本研究進一步的檢測結(jié)果顯示,上調(diào)miR-19b表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)H2O2對SH-SY5Y細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)的抑制作用,提示miR-19b可能通過激活PI3K/AKT信號通路減輕H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

    綜上所述,miR-19b在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷方面發(fā)揮著積極的作用,其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本文結(jié)果進一步揭示了miR-19b在神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用,為其作為改善H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的有效靶點提供了新的參考依據(jù)。但本研究僅在細(xì)胞層面初步探究了miR-19b對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護作用及可能機制,接下來將進一步通過動物實驗驗證miR-19b對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護作用及其他調(diào)控通路。

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