PUF蛋白的研究進(jìn)展

張 靜，王文珍，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321000）

細(xì)胞能夠精準(zhǔn)地控制mRNA在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候在特定的位置產(chǎn)生定量的蛋白質(zhì)，而RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs） 和小 RNA（miRNA）控制著這些進(jìn)程。它們結(jié)合特定的mRNAs，從而控制mRNA的穩(wěn)定性、翻譯過程和定位[1]。一個(gè)RNA結(jié)合蛋白能夠結(jié)合許多的RNA，從而建造一個(gè)龐大的RNA網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控特定的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)結(jié)合RNA有多種多樣的方法，并且通常都難以預(yù)料是以怎樣的方式結(jié)合。目前，存在一些與RNA作用并對其產(chǎn)生影響的工具的使用，類似于短干擾RNA和小分子RNA的使用，但這些工具的使用會(huì)降低目標(biāo)RNA的多樣性和在細(xì)胞中的表達(dá)量[2]。因此，能夠被設(shè)計(jì)的工程性RNA結(jié)合蛋白是十分具有吸引力的，因?yàn)樗鼈兡芘c任何想要的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，能夠選擇性結(jié)合一種特定的RNA目標(biāo)，從而來研究或者控制某一方面的新陳代謝作用。最早在果蠅D.melanogaster中和線蟲C.elegans中分別發(fā)現(xiàn)的PUMILIO和FBF，并以此來命名的PUF蛋白就是這樣一類蛋白質(zhì)[3-4]。PUF蛋白普遍存在于真核生物中，從酵母、果蠅到小鼠、人類都存在同源基因，并且在細(xì)胞分裂、分化及生殖發(fā)育方面有著非常重要的作用。PUF家族蛋白通過結(jié)合于目的mRNA的3′UTR的特定序列，并聚集其他促進(jìn)mRNA降解或影響其翻譯表達(dá)的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)其表達(dá)。PUF蛋白家族大致能夠分為4個(gè)分支，其中2個(gè)分支是細(xì)胞質(zhì)蛋白[5]。啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的PUF3p，PUF4p和PUF5p是細(xì)胞質(zhì)中PUF蛋白的代表，人類中的PUM1也屬于胞質(zhì)類[4]。

果蠅PUMILIO是最原始的一種PUF蛋白，其識(shí)別的RNA序列特異性較為簡單，并且可被預(yù)測。而FBF顯示出與PUMILIO不同的RNA識(shí)別特性。Hunchback（hb）mRNA是其中最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可被PUF蛋白識(shí)別的目標(biāo)，在果蠅中被PUMILIO識(shí)別，其包含一連串的納米響應(yīng)原件（Nanos Response Element，NRE），NRE 序列在 hb mRNA 的表達(dá)過程和胚胎極性建立的過程中是必不可少的[6]。hb NRE的核心序列（5′-U1G2U3A4-U/C5-A6U7A8-3′）是 PUF 蛋白識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)的模型。所有的PUF蛋白都包含一個(gè)特異性序列，即RNA結(jié)合域，也被稱為Pumilio同源域（Pumiliohomology domain，PUM-HD）或PUF結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，PUM-HD包含8個(gè)串聯(lián)的α-螺旋PUF重復(fù)單元，整體呈月牙型。PUF蛋白的RNA識(shí)別序列起始于5′-UGUR（R代表嘌呤），緊接著是一些可變的3′序列，其中可能包含著一些保守元素[4]。人類PUMILIO1（PUM1）結(jié)合于hb RNA的PUM-HD的晶體結(jié)構(gòu)顯示了PUF重復(fù)單元識(shí)別RNA序列的大致原理[9]。RNA結(jié)合于PUM1的內(nèi)凹面，每個(gè)PUF重復(fù)通過3個(gè)保守側(cè)鏈識(shí)別一個(gè)RNA堿基，其中，2個(gè)側(cè)鏈與RNA的堿基邊緣形成氫鍵或者分子間作用力，第3個(gè)側(cè)鏈堆疊在同一堿基或前一個(gè)堿基。RNA與蛋白質(zhì)之間“反向平行”，核酸鏈的1～8位與蛋白質(zhì)的8～1位分別相互識(shí)別（圖1-a）[10]。這種簡單的一個(gè)PUF重復(fù)識(shí)別一個(gè)堿基的識(shí)別模式就是典型PUF蛋白識(shí)別RNA的基本原理。

1 PUF蛋白的研究現(xiàn)狀

1.1 結(jié)構(gòu)研究

人類PUM1與RNA復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)說明特定的PUF重復(fù)識(shí)別特定的堿基。這種簡潔的識(shí)別模式暗示著PUF蛋白結(jié)合序列的堿基特異性可被定點(diǎn)誘變。這種思路已被用于連接效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域或熒光分子與MS2外殼蛋白，但這需要在目的RNA中插入MS2發(fā)卡序列[11]。OPPERMAN[12]研究發(fā)現(xiàn)，蠕蟲中的2種PUF蛋白可以識(shí)別不同長度的核心序列。其中PUF-8識(shí)別8個(gè)堿基的序列，與hb NRE序列相似，而另一種PUF蛋白FBF更傾向于識(shí)別9個(gè)堿基的序列，與hb NRE序列相似，但在其第4，5個(gè)堿基之間還含有一個(gè)額外的堿基。一些研究已經(jīng)證明，自然環(huán)境可以改變PUF蛋白所識(shí)別的RNA的特異性。STUMPF等[13]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在線蟲中RNA特異性極其相似的PUF5和PUF6蛋白都含有10個(gè)堿基的核心序列，以5′UGU開始3′UGU結(jié)束，而這2個(gè)蛋白都只含有8個(gè)重復(fù)序列，說明這些蛋白不是采用一個(gè)重復(fù)結(jié)合一個(gè)RNA堿基的模式，其堿基特異性已經(jīng)被環(huán)境所改變。同樣，在啤酒酵母中也存在類似的證據(jù)。酵母共表達(dá)6種PUF蛋白，這些蛋白調(diào)節(jié)不同的目的RNA[14-15]，基因組學(xué)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其中的PUF4和PUF5分別識(shí)別9個(gè)和10個(gè)堿基的RNA序列。結(jié)構(gòu)生物化學(xué)研究進(jìn)一步闡釋了PUF蛋白的特異性如何適應(yīng)更長的序列。MILLER等[16]用酵母PUF4與其識(shí)別RNA序列的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了9個(gè)堿基的RNA序列如何被8個(gè)PUF重復(fù)所識(shí)別。有了PUF4的晶體結(jié)構(gòu)，就知道了它是如何結(jié)合9個(gè)堿基的目的序列的，而修飾對特異性的改變是否有影響，相同的原理是否適用于其他PUF蛋白呢？對此，OPPERMAN[12]通過構(gòu)建嵌合蛋白，證明了PUF蛋白的特異性可以通過改變嵌入堿基附近的蛋白質(zhì)組分而得到轉(zhuǎn)變。GUPTA[17]用另一種方式研究PUF蛋白對RNA識(shí)別序列的適應(yīng)性，通過研究PUM1結(jié)合非同源RNA序列，結(jié)果顯示，PUM1與2條非同源的RNA序列有相對較高的親和力，證明了PUF蛋白具有通過游離堿基而優(yōu)化識(shí)別目標(biāo)的能力，也暗示著PUF蛋白可以進(jìn)化，從而識(shí)別更長的RNA序列。

目前，PUF蛋白與RNA識(shí)別特點(diǎn)越來越清晰，我們也更清楚地知道，RNA結(jié)合模型是如何識(shí)別比從PUM1結(jié)構(gòu)中預(yù)期的更大范圍的序列。單個(gè)重復(fù)的適應(yīng)性和通過把額外的核苷酸游離于RNA結(jié)合面以外的適應(yīng)能力揭示了為什么PUF蛋白間的RNA結(jié)合序列是高度保守。

1.2 功能研究

隨著PUF蛋白與RNA識(shí)別模式的深入研究，更多人把研究重點(diǎn)放在了PUF蛋白的作用上。不同的生物體間編碼PUF基因的數(shù)量差異非常大，它們在細(xì)胞水平上的功能也不盡相同，目前研究的功能已經(jīng)包括了細(xì)胞分化和發(fā)育[18-19]、生殖細(xì)胞[20]、神經(jīng)功能與記憶[21-23]、細(xì)胞周期[21]以及線粒體生物合成[23]。一直以來，關(guān)于PUF的研究都認(rèn)為，PUF蛋白的典型作用是作為轉(zhuǎn)錄后抑制子[4]，除了這個(gè)作用，在不同的生物體中，PUF蛋白表現(xiàn)出不同的作用。有試驗(yàn)表明，PUF蛋白還有助于mRNA的激活表達(dá)[24-27]和亞細(xì)胞定位[28-30]。

WICKENS等[4]首次闡述了PUF蛋白抑制mRNA表達(dá)的機(jī)制，研究顯示，酵母Puf5特異性地直接結(jié)合于Ccr4-Pop2-NOTmRNA腺嘌呤酶復(fù)合物的Pop2亞基，從而引導(dǎo)腺嘌呤酶到mRNA，這種細(xì)胞質(zhì)核酸外切酶縮短mRNA poly（A）尾巴[31]，對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯都產(chǎn)生影響。PUF蛋白的激活子功能是一個(gè)新的概念，但在不同的生物體中有越來越多的證據(jù)表明PUF蛋白具有該功能[24-27]。目前，基于PUF蛋白的激活機(jī)制還沒有很明確的定義。有證據(jù)顯示[24-27]，PUF蛋白對于mRMA的激活作用可能是直接的，PUF蛋白依賴性的調(diào)節(jié)作用取決于mRNA 3′UTR上的PUF結(jié)合位點(diǎn)。果蠅中的FBF被提到可激活另一個(gè)mRNA gel4，但其機(jī)制還不清楚，很有可能是通過PUF蛋白和microRNA共同合作實(shí)現(xiàn)的[26]。非洲爪蟾蜍也是PUF激活轉(zhuǎn)錄的一個(gè)例子，在其卵母細(xì)胞中，Pum結(jié)合元件（Pum-binding element，PBE）能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活，由細(xì)胞質(zhì)聚腺嘌呤基化（cytoplasmic polyadenylation element-binding，CPEB）和其同源的細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化元件（cytoplasmic polyadenylation element，CPE）介導(dǎo)[24]。但其轉(zhuǎn)錄激活的要求非常嚴(yán)格，如果CPE是非典型的，或CPEB出現(xiàn)二聚體，其激活都會(huì)失敗，這說明Pum的激活作用可能是因?yàn)閰f(xié)同作用，從而使CPEB與轉(zhuǎn)錄子結(jié)合更穩(wěn)定[24]。動(dòng)質(zhì)體目原生動(dòng)物的寄生蟲布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）中也存在基于PUF蛋白的mRNA激活[27]。Puf9能夠在其細(xì)胞周期的S期穩(wěn)定mRNA，Puf9的消耗會(huì)減少與其相互作用mRNA的多樣性，說明Puf9能夠穩(wěn)定其目標(biāo)，但若突變Puf9的結(jié)合區(qū)會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性增加[27]。對此最簡單的解釋是Puf9與轉(zhuǎn)錄抑制子相互競爭目標(biāo)mRMA 3′UTR序列[27]。對于是否所有的PUF蛋白都是激活子和抑制子，或者僅限定于某些PUF蛋白，這仍然是一個(gè)值得研究的問題。

PUF蛋白還具有mRNA定位的功能，對表達(dá)的空間控制具有一定的作用。目前，大多數(shù)關(guān)于PUF蛋白的定位功能都來自于酵母。其Puf3將mRNA定位到線粒體[22，32]，Puf6對ASH1轉(zhuǎn)移到酵母出芽過程中能夠促進(jìn)其不對稱定位[15]，Puf5與過氧化物酶體影響PEX14 mRNA的定位[29]。此外，在果蠅的嗅覺神經(jīng)元中FBF能夠激活周圍胞體和感覺纖毛egl-4 mRNA的翻譯[26]，在哺乳動(dòng)物中Pum2可能參與定位神經(jīng)元中mRNA翻譯[30，33]。有科學(xué)家研究了酵母中Puf6和Puf3的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，Puf6調(diào)節(jié)ASH1 mRNA的翻譯和定位[15]，ASH1編碼一個(gè)只在子細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制子，并不在酵母母細(xì)胞中表達(dá)。這是由于非對稱和編碼的mRNA的表達(dá)[15]。Puf6結(jié)合于ASH1的3′-UTR，通過與翻譯起始因子elF5B/Fun12相互作用，從而抑制其在轉(zhuǎn)移到胚芽過程中的翻譯[28]。當(dāng)ASH1 mRNA到達(dá)了胚芽的目標(biāo)位置，Puf6被CK2激酶磷酸化，這影響了Puf6與mRNA的結(jié)合，從而開啟了ASH1抑制。Puf3與編碼線粒體蛋白的mRNA相互作用[14]，并促進(jìn)其在線粒體中的定位[22]。有試驗(yàn)證明了Puf3在線粒體中的作用，Puf3與線粒體定位mRNA發(fā)生免疫共沉淀[14]、puf3誘變體中會(huì)出現(xiàn)mRNA的錯(cuò)誤定位[23]、Puf3與線粒體的結(jié)合是通過其與ERMES（ER-Mitochondria Encounter Structure）的亞基Mdm12相互作用[32]。除了有助于mRNA的定位，Puf3還會(huì)抑制其mRNA并使其脫腺苷化[32，34-35]，目前，還不清楚 Puf3在mRNA定位和抑制間有什么聯(lián)系。

1.3 在植物中的研究進(jìn)展

目前，大多數(shù)基于PUF蛋白的研究都集中在酵母、果蠅等模式生物中，也有科學(xué)家研究了擬南芥和水稻中的PUF基因家族，發(fā)現(xiàn)這2種模式植物的PUF基因家族成員比其他模式物種多得多，可能是由于整個(gè)基因組的復(fù)制導(dǎo)致了大量的PUF基因[4]。這些大量的PUF蛋白家族成員暗示著它們在細(xì)胞中對相關(guān)RNA的穩(wěn)定和翻譯是非常重要的。植物PUF蛋白早期只在關(guān)于植物發(fā)展史形成的文獻(xiàn)中稍有提及[4，36-38]，也有個(gè)別文獻(xiàn)[39]提到擬南芥中PUF蛋白潛在目標(biāo)mRNA的鑒定。近年來，有文獻(xiàn)[40-41]針對植物中PUF蛋白的作用進(jìn)行了研究。而植物中由于PUF基因家族數(shù)目的龐大，其功能涉及廣泛，目前還未研究透徹。

2 結(jié)論

最近證據(jù)顯示，PUF是多功能的mRNA調(diào)節(jié)子，可以作為抑制子、激活子以及mRNA定位因子?；谶@些調(diào)節(jié)子對細(xì)胞分化、發(fā)育以及干細(xì)胞維持等過程的影響，可以認(rèn)為，PUF蛋白家族采用多種機(jī)制來調(diào)節(jié)目標(biāo)RNA，從而行使不同的細(xì)胞功能。PUF家族對于RNA定位的廣泛作用和其識(shí)別作用與mRNA的抑制和激活是如何相互協(xié)調(diào)的都還不是很清楚。所以，目前需要解決的是PUF蛋白是如何調(diào)節(jié)眾多特定的目標(biāo)mRNA，是激活還是抑制，或者二者都有？PUF依賴的調(diào)節(jié)對于細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)又是怎樣變化的？更多的是，我們應(yīng)該形成一種mRNA靶向功能的共同認(rèn)識(shí)，這就能更清晰地知道PUF目標(biāo)mRNA的亞細(xì)胞定位以及這種定位是如何依賴于PUF的，并且有助于啟發(fā)我們?nèi)ヌ剿骰虻臅r(shí)空表達(dá)與PUF作用的相互聯(lián)系。

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