c-Met基因過表達臍帶間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建*

張永婷，朱傳龍，李軍，章莉莉

目前進行細胞移植治療的種子細胞主要來源于自體骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），但因取材有創(chuàng)，獲得細胞數(shù)量有限。隨著年齡增長，人體骨髓MSC細胞數(shù)量及細胞活性明顯下降。人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUMSC）作為工具細胞，具有分化潛能強、來源豐富、無倫理爭議等優(yōu)點，同時免疫原性低、免疫調(diào)控功能和自我更新能力強大，可作為治療肝衰竭的種子細胞[1]。趙思達將hUMSC移植到肝衰竭大鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)能顯著改善肝功能，減輕肝臟損傷，促進肝細胞再生，提高了動物存活率[2]。細胞間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（cellular mesenchymal to epithelial transition factor，c-Met）是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的特異性受體，由50 kD的α鏈和145 kDa的β鏈通過二硫鍵組成異源二聚體[3]。C-Met與HGF特異性結(jié)合后，酪氨酸激酶自主磷酸化激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮促進細胞增殖、遷移、血管生成、抗纖維化、抗凋亡等作用[4-6]。Trapp T et al[7]發(fā)現(xiàn) HGF/c-Met軸可促進間充質(zhì)干細胞遷移至損傷部位。間充質(zhì)干細胞c-Met表達量與其遷移能力密切相關(guān)[8]。還有研究結(jié)果表明肝臟損傷后HGF水平增加，可上調(diào)MSC中c-Met與磷酸化Met的表達，促進MSC遷移至肝臟，進一步減輕肝損傷[9]。敲除c-Met基因能損傷干細胞的遷移及向肝細胞分化能力，并進一步抑制了肝組織的修復(fù)[10]。本文旨在建立c-Met基因過表達的hUMSC，并移植治療肝衰竭大鼠，觀察該方法是否可促進hUMSC遷移至受損肝臟部位，并觀察其向肝細胞分化的能力。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人臍帶間充質(zhì)干細胞（由江蘇省人民醫(yī)院干細胞臨床實驗研究基地提供），胎牛血清（Corning公司，美國），DMEM 低糖培養(yǎng)基（HyClone公司，美國），PBS粉末（Sigma公司，美國），重組人表皮生長因子（hEGF）和重組人生長因子（hEGF）（PeroTech公司，美國），胰蛋白酶（碧云天公司），抗人 CD31、CD34、CD44、CD45、CD90 和CD109抗體（Biolegend公司，美國），構(gòu)建成功慢病毒重組載體GV358-c-Met（上海吉凱公司），嘌呤霉素（Amresco公司，美國），凝聚胺（Sigma公司，美國），兔抗人c-met（abcam公司,英國），兔抗人β-actin（abcam公司,英國），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 lgG（杭州聯(lián)科公司），細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），超凈臺和熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司)，制冰機（廈門國儀科學儀器公司）。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)與鑒定 取凍存P2代hUMSCs，37℃水浴復(fù)蘇后鋪板，使用含10%血清，10 ng/ml的hEGF和hbFGF低糖DMEM培養(yǎng),培養(yǎng)至P5代細胞。取P5代hUMSC進行流式細胞儀鑒定，分別取100μlhUMSC細胞懸液，加入到流式管中，每管細胞總數(shù)為1×105個。分別在各流式管中加入抗體 PE-CD31、PE-CD34、PE-CD45、FITC-CD44、FITC-CD45和FITC-CD105，隨后避光冰浴30 min，PBS洗滌后離心，放入流式細胞儀檢測，并記錄結(jié)果。

1.3 確定嘌呤霉素篩選濃度 取對數(shù)生長期的hUMSC，接種于6孔板，待2～3 d各孔細胞長滿后，重新各孔加入含梯度濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基2 ml，各孔嘌呤霉素濃度分別為 0 μg/ml、1 μg/ml、1.4 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml和 4 μg/ml，顯微鏡下每日觀察各孔細胞生長情況。2～3 d換液，加入含有相應(yīng)濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，以4 d可完全殺死相應(yīng)孔中全部細胞的最低嘌呤霉素濃度為最終藥物篩選濃度。

1.4 最適多重感染復(fù)數(shù)（multiple of infection,MOI）的篩選 轉(zhuǎn)染前24 h，取第五代hUMSCs，以5×104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染時細胞融合至30%～40%。次日，用含有5 μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基200μl替換原培養(yǎng)基，加入滴度為2×108TU/ml，MOI 依 次 為 0、10、30、50、80、100 的c-Met病毒懸液，37℃孵育。12 h后，加入新鮮培養(yǎng)基200μl，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，陽性細胞在熒光顯微鏡下顯示為綠色，計算同一視野下陽性細胞與總細胞數(shù)百分比。根據(jù)以下公式計算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染效率90% 以上的最低MOI值即為最適MOI。

1.5 c-Met重組慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞及轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素的篩選 取第五代hUMSCs，以5×105個/ml接種于24孔培養(yǎng)板，分為對照組和實驗組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。按照上述方法進行轉(zhuǎn)染，實驗組按最佳 MOI值加入重組慢病毒Lenti-GFP-c-Met，對照組加入等體積的陰性病毒液Lenti-GFP，48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，72 h后向培養(yǎng)基中加入最終濃度的嘌呤霉素篩選。1 w后，在熒光顯微鏡下觀察篩選效果，待顯微鏡下熒光效率接近或者高于99%時，將藥物濃度維持在1/5篩選濃度，即獲得穩(wěn)定表達c-Met基因的臍帶間充質(zhì)干細胞株。

1.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株c-Met蛋白表達的檢測 采用Western blot法，分別取實驗組和對照組相同數(shù)目的細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，采用冷凍干燥技術(shù)調(diào)整各個蛋白樣品濃度為5 g/L。隨后，取待測樣品與5×蛋白上樣緩沖液按照4:1體積進行混合，充分混勻后，放于沸水中煮5 min，裝置好電泳設(shè)備，每孔按照20μg蛋白量上樣，根據(jù)已知濃度算出每孔對應(yīng)蛋白體積，加入Marker 10μl，進行 10%SDS-PAGE電泳。進行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，TBST緩沖液洗膜，室溫封閉2 h，分別加兔抗人c-Met（1∶500），兔抗人β-actin（1∶1 000），4℃過夜，用TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下孵育 2 h。用TBST緩沖液洗膜，按ECL試劑盒說明進行化學發(fā)光檢測，暗室中進行X線片曝光顯色，使用Image J軟件進行條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與鑒定情況 培養(yǎng)至P5代的hUMSC細胞呈長梭形，或旋渦狀生長，細胞排列緊密，大小一致，形態(tài)均一（圖1）。經(jīng)流式細胞儀檢測顯示P5代細胞表面CD44、CD90和CD105表達陽性均在96%以上（分別為99.7%、97.7%和96.4%），而CD31、CD45和CD34表達均低于3%（圖2），上述結(jié)果符合間充質(zhì)干細胞特性。

圖2 第五代hUMSC表面鑒定結(jié)果A:CD105+，CD34-；B:CD90+，CD45-；C:CD44+，CD31-

2.2 篩選嘌呤霉素藥物濃度情況 經(jīng)不同濃度的嘌呤霉素處理hUMSCs 4 d，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在藥物濃度為1.4 μg/ml時，即可殺死全部細胞，故最終確定嘌呤霉素篩選濃度為1.4 μg/ml（圖3）。

圖3 不同濃度嘌呤霉素篩選1 w結(jié)果（40×）A:0 μg/ml；B:1 μg/ml；C:1.4 μg/ml

2.3 c-met重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染hUMSCs及轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素篩選情況 在轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下即可見綠色熒光，GFP陽性細胞占總細胞的50%（圖4）；在轉(zhuǎn)染72 h后，加入嘌呤霉素篩選，濃度為1.4μg/ml。經(jīng)藥物篩選1 w后在熒光顯微鏡下觀察熒光，發(fā)現(xiàn)熒光陽性率大于99%（圖 5），即形成穩(wěn)定表達c-met基因的人臍帶間充質(zhì)干細胞株（c-met-hUMSC），收集細胞凍存、備用。

2.4 c-met-hUMSC細胞c-Met蛋白表達情況 經(jīng)Western blot檢測顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-met的hUMSCs細胞顯著表達c-Met蛋白，明顯高于對照組hUMSCs的c-met表達水平（圖 6）。

圖4 培養(yǎng)細胞表現(xiàn) hUMSCs轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光（MOI=80，40×）A：白光視野；B：熒光視野

圖5 培養(yǎng)細胞表現(xiàn) 經(jīng)嘌呤霉素篩選hUMSC 1 w后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光（40×）A：白光視野；B：熒光視野

圖6 細胞c-Met蛋白表達情況A：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 c-Met的 hUMSCs組；B：hUMSCs組

3 討論

其中MSC是一類來源于中胚層非造血的干細胞，其可體外增殖、分化、歸巢至損傷部位，改善炎性微環(huán)境[11，12]。MSC 主要從骨髓、脂肪、臍帶中提取[13]，與骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞相比，hUMSC具有一些優(yōu)勢：①無創(chuàng)性。臍帶作為醫(yī)學廢物不會給捐獻者造成新的創(chuàng)傷和痛苦；②來源豐富。每年有大量新生兒出生，一般不涉及醫(yī)學倫理學問題；③hUMSC 表達OCT-4、Sox-2、Nanog等轉(zhuǎn)錄因子，原始且免疫原性低，同時具有更強的增殖能力和可塑性；④hUMSC在體內(nèi)外誘導(dǎo)因素作用下可分化為肝樣細胞[14]。大量實驗證明輸入MSC到體內(nèi)后并沒有長期停留，而且隨著時間的延長被機體清除。將人MSC通過頸靜脈移植到大鼠體內(nèi)，1 h后，大鼠體內(nèi)檢測到的MSC已減少到了82%左右，8 d后只能檢測到0.06%。外周靜脈輸入MSC后，大部分MSC滯留在肺部，然后隨著血流到達肝臟等部位[15]。臨床研究結(jié)果亦表明移植MSC在短期內(nèi)可改善肝衰竭患者病情，但長期觀察肝功能無明顯變化[16，17]。

在肝衰竭發(fā)生過程中，肝臟間質(zhì)細胞產(chǎn)生大量的HGF，后者通過與受體c-Met結(jié)合形成信號通路，促進細胞再生，誘導(dǎo)細胞遷移等[18]。C-Met作為HGF的特異性受體，具有酪氨酸激酶活性，可促進細胞增殖分化、形態(tài)發(fā)生和侵襲運動。但肝細胞再生取決于肝細胞表面細胞膜上c-Met的激活，而不是單純HGF的水平增加。敲除小鼠c-Met基因嚴重影響肝細胞的存活和肝組織修復(fù)功能[19]。肝衰竭大鼠血清HGF水平升高，但c-Met蛋白表達水平卻明顯降低[20]。肝大部切除大鼠血清HGF和c-Met水平均升高，表明c-Met在肝細胞再生中起到重要作用。以上研究結(jié)果提示可以通過基因修飾，以提高hUMSC細胞c-Met的表達，移植c-Met高表達的hUMSC細胞能夠更好地定向歸巢于損傷肝組織?；蛑委熥鳛橐环N治療手段已初見成效，其中載體細胞的選擇至關(guān)重要，hUMSC可自我更新，分化為肝樣細胞，異體移植時不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，成為組織工程研究的熱門工具細胞。同時，慢病毒載體轉(zhuǎn)染干細胞能力強，能夠保證目的基因長期高效表達，且細胞毒性較低。

本實驗通過構(gòu)建慢病毒重組載體GV358-c-Met轉(zhuǎn)染hUMSCs，用嘌呤霉素抗性基因篩選后獲得成功穩(wěn)定表達c-Met基因的hUMSC細胞。該細胞的建立為下一步觀察c-Met是否促進hUMSC歸巢于損傷肝臟組織，促進肝細胞再生，以及以后是否可作為治療肝衰竭患者的一種新方法提供了實驗基礎(chǔ)。

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