茵梔黃口服液對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪變的保護(hù)作用研究*

劉曉琳，信豐智，楊蕊旭，趙澤華，周達(dá)，潘勤，范建高

NAFLD包括單純性非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[1-2]。雖然前者可通過飲食控制和運(yùn)動(dòng)鍛煉來逆轉(zhuǎn)，但NASH有進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。茵梔黃口服液的主要成分是茵陳、梔子、黃芩和金銀花的提取物，具有清熱解毒、退黃、降酶的功效[4-6]。茵梔黃口服液在臨床上被廣泛用于自身免疫性肝炎和新生兒黃疸等疾病的治療[7]。有研究報(bào)道，在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠和卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠，茵梔黃口服液均可有效地降低血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平[8-10]。本研究旨在觀察茵梔黃口服液對(duì)蛋氨酸膽堿缺乏（methionine and choline deficient，MCD）飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠血清學(xué)和肝組織病理學(xué)變化的改善情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備 30只6周齡SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，標(biāo)準(zhǔn)飼料和MCD飼料購自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，茵梔黃口服液由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供。將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MCD組和茵梔黃組，每組10只，飼養(yǎng)于上海睿太莫斯生物科技有限公司，動(dòng)物房恒溫（24℃±2℃）、恒濕（50%±5%），動(dòng)物自由進(jìn)食水。在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，給予對(duì)照組大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料、給予其余兩組大鼠MCD飼料喂養(yǎng)。在第4 w末，分別給予MCD組和茵梔黃組大鼠生理鹽水和茵梔黃口服液灌胃（15 ml·kg-1），1 次 /d，持續(xù)至第8 w末，期間每周測量體質(zhì)量。在第8 w末，將大鼠隔夜禁食后稱質(zhì)量，給予戊巴比妥鈉麻醉，采用眼底靜脈叢取血法采集血液，靜置凝固后，3000 g離心10 min，收集血清，分裝后置于-80℃冰箱保存。同時(shí)，迅速剪下完整的肝臟，稱取肝質(zhì)量，切取0.5×0.5×0.5 cm大小的肝組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，剩下的肝組織置于液氮中凍存。

1.2 肝組織病理學(xué)檢查 根據(jù)NAFLD活動(dòng)度積分（NALFD activity score，NAS）和纖維化評(píng)分對(duì)大鼠肝組織病理學(xué)特征進(jìn)行評(píng)分，其中包括肝細(xì)胞脂肪變（0～3分）、小葉內(nèi)炎癥（0～3分）、肝細(xì)胞氣球樣變（0～2分）和肝纖維化（0～4分）。當(dāng)NAS＜3分，排除NASH，NAS＞4分確診為 NASH，NAS=3或4分，為臨界NASH[11]。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)作圖。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)比較 MCD飼料喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量逐漸降低（圖1A）。至第8 w末，MCD組大鼠體質(zhì)量為（155.8±3.1）g，顯著低于對(duì)照組的（487.2±6.5）g，而茵梔黃口服液灌胃對(duì)MCD大鼠體質(zhì)量無顯著的影響（圖1B）；在第8 w末，MCD組大鼠肝指數(shù)為（5.09±0.19）%，顯著高于對(duì)照組的【（2.92±0.06）%，P＜0.05】；茵梔黃治療組大鼠肝指數(shù)為（4.47±0.18）%，顯著低于 MCD 組（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05，圖 1C），提示茵梔黃口服液可顯著改善MCD大鼠肝指數(shù)水平。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)變化比較

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化的比較 在第8 w末，MCD組大鼠肝組織肝細(xì)胞呈大泡性脂肪變和炎癥細(xì)胞浸潤，而茵梔黃處理組大鼠肝組織病變明顯緩解；MCD組大鼠肝組織出現(xiàn)輕度肝纖維化，而茵梔黃組肝纖維化程度減輕。MCD組大鼠肝臟脂肪變?cè)u(píng)分都為3分，氣球樣變?cè)u(píng)分都為2分，小葉內(nèi)炎癥明顯，因此MCD組大鼠都被診斷為NASH。與MCD組比，茵梔黃灌胃組大鼠肝臟脂肪變?cè)u(píng)分改善，肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分顯著降低，小葉炎癥評(píng)分顯著降低（表1）。MCD組NAS積分顯著升高，而茵梔黃灌胃組則明顯降低）。MCD組肝纖維化評(píng)分顯著升高，而茵梔黃組顯著低于MCD組（圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

表1 各組大鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分（±s）比較

表1 各組大鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與 MCD 組比，②P＜0.05

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2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 因?yàn)楸狙芯渴褂玫膭?dòng)物模型為營養(yǎng)缺乏模型，不具有臨床NAFLD患者典型的血脂血糖代謝紊亂表現(xiàn)，所以在該研究中尚未發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液對(duì)血脂和血糖的顯著改善作用（表2），提示茵梔黃口服液可以顯著降低MCD大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，而對(duì)血脂和血糖的影響可能需要高脂誘導(dǎo)的動(dòng)物模型來證實(shí)。

3 討論

本研究采用MCD飲食誘導(dǎo)NASH大鼠模型，探討了茵梔黃口服液對(duì)于肝脂肪變大鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液可以減輕MCD處理大鼠肝指數(shù)，改善NASH的肝臟脂肪變、肝細(xì)胞氣球樣變、小葉炎癥和纖維化，同時(shí)降低NASH大鼠血清ALT和AST水平。

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與 MCD 組比，②P＜0.05

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現(xiàn)代藥理學(xué)的多項(xiàng)研究結(jié)果提示，茵梔黃的主要成分茵陳可促進(jìn)膽汁酸分泌和排泄，主要用于治療黃疸[12]；梔子苷具有涼血解毒、促進(jìn)膽汁分泌和活血化瘀的作用[13]；黃芩中的黃芩苷可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)膽囊收縮[14]；金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥，其中的黃酮可以抗病毒、抗氧化、減輕肝細(xì)胞損傷[15]。因此，茵梔黃口服液可以促進(jìn)膽汁的分泌和排泄，直接參與酶的激活進(jìn)而影響糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)促進(jìn)肝臟再生、維持肝細(xì)胞的完整性，使其免遭脂質(zhì)過氧化物的損傷[16]。

肝臟脂肪變、氣球樣變和小葉炎癥（伴或不伴纖維化）是非酒精性脂肪性肝病最典型的病理學(xué)特征。我們首次發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液可以使MCD誘導(dǎo)大鼠的肝臟脂肪變程度減輕，提示該藥物對(duì)于NASH的肝臟脂肪變具有一定的治療療效，這是在其他研究中尚未有報(bào)道的。另外，我們的研究也首次發(fā)現(xiàn)了茵梔黃口服液可以使MCD大鼠的肝細(xì)胞氣球樣變出現(xiàn)一定程度的減輕。同時(shí)，與我們的研究結(jié)果類似，來自南方醫(yī)科大學(xué)的團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃口服液可以顯著改善肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝臟炎癥細(xì)胞浸潤和壞死性改變，提示茵梔黃口服液可以顯著改善肝病大鼠的肝內(nèi)炎癥[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液可減輕MCD誘導(dǎo)大鼠的肝臟小葉內(nèi)炎癥，提示該藥也可以用于治療NASH的肝內(nèi)炎癥。有文獻(xiàn)報(bào)道茵梔黃口服液可以用于輔助治療新生兒膽道閉鎖，減少患兒肝纖維化的發(fā)生[18]，而目前尚未有茵梔黃口服液對(duì)NAFLD誘導(dǎo)的肝纖維化治療有效的報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃口服液緩解MCD誘導(dǎo)大鼠的肝臟纖維化的效果非常顯著，給予MCD誘導(dǎo)大鼠茵梔黃口服液灌胃后，其肝臟纖維化程度幾乎可恢復(fù)至正常，提示該藥物對(duì)NASH大鼠肝臟纖維化病變有一定的治療效果。

已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃口服液可以改善脂肪肝以及NAFLD患者的血清學(xué)指標(biāo)[6，19]。與這兩項(xiàng)研究結(jié)果類似，我們也觀察到茵梔黃口服液可以顯著改善MCD誘導(dǎo)大鼠血清ALT和AST水平，但是我們沒有觀察到該藥對(duì)大鼠血清糖脂代謝指標(biāo)（包括 TC、TG、HDL、LDL和 FBG）有影響。原因可能是因?yàn)槲覀儾捎玫腗CD誘導(dǎo)大鼠模型為蛋氨酸和膽堿缺乏的動(dòng)物模型，雖然可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變和肝內(nèi)炎癥，但其體質(zhì)量顯著下降，不具有臨床NAFLD患者能量過剩狀態(tài)以及胰島素抵抗和血脂紊亂的特征，所以無法完全模擬臨床NAFLD患者的代謝紊亂狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液可以調(diào)控炎癥介質(zhì)和抑制氧化應(yīng)激，臨床上已經(jīng)被廣泛地用來治療新生兒黃疸[20]，但是我們的研究沒有觀察到其對(duì)血清TBIL的顯著改善作用，可能與我們使用的MCD誘導(dǎo)大鼠模型和治療時(shí)間短有關(guān)。本研究使用MCD飼料喂養(yǎng)的大鼠不是典型的膽汁淤積動(dòng)物模型，所以不具備顯著的膽紅素水平升高的表現(xiàn)，給予MCD誘導(dǎo)大鼠茵梔黃口服液灌胃治療后，可看到動(dòng)物血清TBIL水平下降，但與其他組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因臨床上使用中藥治療的療程一般較長，因此延長治療時(shí)間可能會(huì)使MCD誘導(dǎo)大鼠血清膽紅素下降。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃口服液可以改善MCD誘導(dǎo)的NASH大鼠的肝臟脂肪變、氣球樣變、小葉炎癥和肝纖維化，降低NASH大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，但未能證實(shí)茵梔黃口服液對(duì)NASH大鼠血脂和血糖有顯著的影響，后續(xù)研究可以通過高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠模型來進(jìn)一步探索和驗(yàn)證茵梔黃口服液對(duì)NAFLD動(dòng)物糖脂代謝的影響。

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