食用糖漿及其原料轉(zhuǎn)基因成分的熒光PCR檢測

閆超杰, 張旭東, 付海濱, 李俊環(huán), 張 敏

(1. 錦州出入境檢驗檢疫局, 遼寧 錦州 121013; 2. 沈陽出入境檢驗檢疫局, 遼寧 沈陽 110016;3. 沈陽檢驗檢疫科學(xué)研究院, 遼寧 沈陽 110016; 4. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 遼寧 沈陽 110016)

食用糖漿制品(葡萄糖漿、麥芽糖漿和麥芽糊精等)主要以玉米淀粉為加工原料,經(jīng)調(diào)漿、液化、糖化、脫色、離子交換、蒸發(fā)濃縮等多步工序精制而成,被廣泛應(yīng)用于糖果、糕點(diǎn)、飲料、冷凍食品、調(diào)味品、保健品等各個領(lǐng)域[1].近幾年來,隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛使用,轉(zhuǎn)基因作物的種植面積和商業(yè)化應(yīng)用逐年升高[2-3],而公眾對于轉(zhuǎn)基因食品關(guān)注度也日益提高.據(jù)報道,我國違規(guī)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米品種在遼寧、吉林、山西、四川、湖南、貴州等省種植面積占全國玉米種植總面積的1/10.可見作為我國國民主食的玉米,其轉(zhuǎn)基因境況已令人堪憂,而以玉米作為加工原料的食用糖漿行業(yè)也將面臨更大的風(fēng)險考驗.

目前,國內(nèi)外對于食用糖漿的檢測基本僅限于理化、農(nóng)殘和微生物檢測.與食用糖漿性質(zhì)大致相同類別的蜂蜜中,其轉(zhuǎn)基因成分的檢測已有研究.饒紅建立了出入境行業(yè)檢驗標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分檢測方法聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法和實時熒光(Quantitative Real-time)PCR方法[4];張秀杰建立了以轉(zhuǎn)基因棉花為蜜源的蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測[5].深度加工產(chǎn)品的DNA提取是轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域的一大難題[6-9],而糖漿制品轉(zhuǎn)基因成分的檢測尚無報道.本研究重點(diǎn)對玉米深度加工產(chǎn)品中的食用糖漿制品(麥芽糖漿、葡萄糖漿和麥芽糊精)及其原料玉米淀粉進(jìn)行基因組DNA提取優(yōu)化和實時熒光PCR檢測,建立了糖漿制品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR檢測體系,取得了較為滿意的實驗結(jié)果,解決了糖漿制品DNA成分檢測的難題.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1) 材料.本研究所使用的實驗材料:葡萄糖漿、麥芽糖漿、麥芽糊精及玉米陰陽性對照樣品均為本實驗室留存的送檢樣品,玉米淀粉樣品為當(dāng)?shù)卮笮统匈徺I.

(2) 主要試劑.深加工食品DNA提取試劑盒(GMO food DNA Extraction Kit),購于天根生物科技(北京)有限公司;實時熒光PCR反應(yīng)體系(Premix Ex Taq),購于寶生物工程(大連)有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇等試劑均為分析純或生化級試劑,購于當(dāng)?shù)卦噭┕?實驗用水均為超純水.

CTAB提取液: 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的CTAB, 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)50 mmol·L-1(PH為8.0),Tris-HCl 100 mmol·L-1(pH為8.0),NaCl 140 mmol·L-1.

CTAB沉淀液: 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的CTAB,NaCl 40 mmol·L-1.

磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH為7.4): NaCl 137 mmol·L-1, KCl 2.7 mmol·L-1, Na2HPO4·12H2O 10 mmol·L-1, NaH2PO41.8 mmol·L-1,實驗時稀釋成1倍PBS液使用.

1.2 主要儀器設(shè)備

熒光定量PCR儀(ABI STEPONE)、高速臺式離心機(jī)(SIGMA 2-16P)、高速冷凍離心機(jī)(SIGMA 3K15)、恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、漩渦混合器、微型離心機(jī)等.

1.3 引物與探針

由于本實驗使用的材料為玉米深加工制品,未知其具體的轉(zhuǎn)基因成分,因此僅檢測玉米的內(nèi)源ZEIN和轉(zhuǎn)基因作物基本都具有的啟動子CaMV35S和終止子NOS成分.所有引物和探針均委托寶生物工程(大連)有限公司合成,用滅菌雙蒸水稀釋至濃度為10 μmol·L-1,-20 ℃?zhèn)溆帽４?引物和探針序列見表1.

表1 實時熒光PCR檢測所用引物和探針Table 1 Primers and fluorescent probes forreal-time PCR

1.4 食用糖漿和玉米淀粉DNA提取

由于糖漿類制品均為液體狀態(tài),所以參照邵碧英等發(fā)表的醬油和蜂蜜兩種液體類樣品的DNA提取預(yù)處理方法對麥芽糖漿進(jìn)行預(yù)處理[5,10],再應(yīng)用CTAB法[11-15]和深加工試劑盒法[16]分別提取DNA成分,比較各方法組合提取DNA的產(chǎn)量和效率,通過技術(shù)整合,建立適用于食用糖漿DNA提取的方法.玉米淀粉DNA提取按照GMO food DNA Extraction Kit說明進(jìn)行操作.

1.4.1 糖漿預(yù)處理方法

預(yù)處理1(CTAB沉淀液法):取麥芽糖漿樣品50 mL,分裝于10個10 mL的離心管中(每管5 mL),每管再加入5 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB沉淀液,充分混勻后室溫放置1 h;室溫下12 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,在每管沉淀中分別加入1 mL PBS緩沖液,溶解后合并于1個10 mL離心管中,室溫下12 000 r·min-1離心10 min, 棄上清液,取沉淀.

預(yù)處理2(PBS緩沖液法):取麥芽糖漿樣品50 mL,分裝于10個10 mL的離心管中(每管5 mL),每管再加入5 mL 65 ℃預(yù)熱的PBS緩沖液,充分混勻后室溫12 000 r·min-1離心10 min,;后同預(yù)處理1.

1.4.2 糖漿DNA提取方法

(1) 深加工試劑盒法(略作修改).向沉淀中加入500 μL緩沖液GMO1和20 μL蛋白酶K,渦旋混合1 min后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中;65 ℃孵育1 h,孵育過程中每15 min顛倒混合一次;加入200 μL緩沖液GMO2,充分混勻,渦旋混合1 min,室溫靜置10 min;若溶液渾濁,則加入700 μL的三氯甲烷顛倒混合后,13 000 r·min-1離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中,加入500 μL的異丙醇,充分混勻后,4 ℃靜置30 min,13 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,保留沉淀;加入800 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,渦旋震蕩后13 000 r·min-1離心3 min,棄上清液;再重復(fù)用乙醇溶液清洗1次后,開蓋將離心管放置于40 ℃干燥箱中烘干20 min左右,徹底去除殘余的乙醇后,加入20 μL TE緩沖液,將沉淀充分溶解后得到DNA溶液.

(2) CTAB法. 向沉淀中加入 1mL CTAB提取液和20 μL蛋白酶K, 渦旋混合1 min后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中; 65 ℃孵育30 min, 孵育過程中每10 min顛倒混合1次; 加入1 mL的三氯甲烷-異戊醇液(V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1), 顛倒混合后13 000 r·min-1離心10 min, 取上清液加入2 mL的CTAB沉淀液, 室溫放置1 h; 13 000 r·min-1離心10 min, 取沉淀, 加入500 μL NaCl 溶液溶解沉淀, 再加入500 μL的三氯甲烷渦旋混勻后, 13 000 r·min-1離心10 min, 取上清液加入350 μL的異丙醇, 充分混勻后,4 ℃靜置30 min,13 000 r·min-1離心10 min, 棄上清液, 保留沉淀; 加入800 μL 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,渦旋震蕩后, 13 000 r·min-1離心3 min, 棄上清液; 再重復(fù)用乙醇溶液清洗1次后, 開蓋將離心管放置于40 ℃干燥箱中烘干20 min左右, 徹底去除殘余的乙醇后, 加入20 μL TE緩沖液, 將沉淀充分溶解后得到DNA溶液.

1.5 實時熒光PCR檢測

PCR反應(yīng)體系包括Premix Ex Taq 12.5 μL,ROX Reference Dye 0.5 μL,高純H2O 8 μL,引物1 μL,探針1 μL,樣品DNA模板5 μL,共計28 μL.反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性10 s, 95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸34 s,55個循環(huán).

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽糖漿DNA提取結(jié)果

糖漿制品是以玉米淀粉為原料經(jīng)過再次加工而形成的產(chǎn)品,由于在二次加工過程中經(jīng)過一系列物理化學(xué)步驟,其玉米的DNA成分已被大量降解并嚴(yán)重破壞[17-24],導(dǎo)致糖漿制品中僅存在極微量核酸,且多為小片段.因此糖漿制品的DNA提取成為后續(xù)PCR檢測能否成功的關(guān)鍵.

以麥芽糖漿為試材進(jìn)行DNA提取預(yù)實驗,結(jié)果如表2和圖1所示.

表2 經(jīng)2種預(yù)處理和2種DNA提取方法獲得麥芽糖漿DNA檢測結(jié)果

注：Ct值(cycle threshold)為循環(huán)閾值, 即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù); —表示未檢出;空白對照為Premix Ex Taq 12.5 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、ddH2O 8 μL、引物各1 μL、探針1 μL的混合溶液.下同.

圖1 麥芽糖漿DNA擴(kuò)增圖譜

由表2可以看出,用預(yù)處理1(CTAB沉淀液法)對麥芽糖漿進(jìn)行預(yù)處理,然后應(yīng)用CTAB法和深加工試劑盒法2種DNA提取方法均未檢測到其DNA成分;而用預(yù)處理2(PBS緩沖液法)對麥芽糖漿進(jìn)行預(yù)處理,再采用兩種DNA提取方法可以檢測到麥芽糖漿中的玉米內(nèi)源基因.分析可知,雖然CTAB沉淀液具有沉淀DNA的作用,但糖漿制品屬于DNA破壞比較嚴(yán)重的深加工產(chǎn)品,加之糖漿液體比較粘稠,且PBS緩沖液具有鹽平衡、調(diào)整適宜pH值、保護(hù)溶液生物活性物質(zhì)的作用,所以預(yù)處理2可以讓糖漿制品中DNA不被破壞,最大限度地沉降下來.此外,由于深加工試劑盒法相對CTAB法步驟簡便,用時更少,檢測Ct值相對較低,因此,選用預(yù)處理2(PBS緩沖液法)和深加工試劑盒組合方法作為糖漿類制品DNA提取方法.圖1為預(yù)處理2結(jié)合深加工試劑盒法提取麥芽糖漿DNA的實時熒光PCR擴(kuò)增圖譜.從圖1可以看出,該DNA組合提取法成功提取出了麥芽糖類的內(nèi)源基因ZEIN,但外源基因CaMV35S和NOS由于樣品本身不含有或已被嚴(yán)重破壞而未被檢測出.

2.2 3種糖漿制品DNA成分檢測結(jié)果

以麥芽糖漿、葡萄糖漿和麥芽糊精為實驗材料,用以上建立的方法提取DNA,每個樣品重復(fù)實驗3次,其檢測結(jié)果如表3所示.3種糖漿制品中的內(nèi)源基因ZEIN的平均Ct值均在37.5～38.5之間,且其中均未檢出外源基因成分.

表3 3種糖漿制品實時熒光PCR檢測結(jié)果

2.3 糖漿原料(玉米淀粉)DNA成分檢測結(jié)果

以隨機(jī)購買的6種玉米淀粉為實驗材料,用深加工食品DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取,熒光PCR檢測結(jié)果顯示(見表4),1、2、3、4、5號玉米淀粉樣品中均檢出外源基因成分,只有6號玉米淀粉未檢出轉(zhuǎn)基因成分,其中1～5號樣品均檢出外源基因CaMV35S,3號和5號樣品檢出外源基因NOS成分.

表4 6種玉米淀粉樣品實時熒光PCR檢測結(jié)果Table 4 Real-time PCR results of six corn starch samples

3 結(jié) 論

本文采用了加大取樣量(取10管共50 mL樣品)、PBS緩沖液預(yù)處理、深加工食品DNA試劑盒核酸提取、富集DNA溶液總體積20 μL、加大反應(yīng)體系DNA模板量(每孔5 μL)的方法,使微量核酸共沉富集,大大提高了糖漿制品中核酸的提取效率,成功提取到了糖漿制品的內(nèi)源基因.雖然在3種糖漿制品中均未檢出外源基因成分,但在實驗過程中也對其原料(玉米淀粉)樣品的DNA成分也進(jìn)行了提取和實時熒光PCR檢測,結(jié)果在購買的6份玉米淀粉樣品中有5份被檢測出含有外源轉(zhuǎn)基因成分,因此,也不能排除外源基因在糖漿加工過程中被嚴(yán)重破壞導(dǎo)致檢測不出的可能.本研究還建立了食用糖漿中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR定性檢測方法,解決了糖漿制品DNA成分檢測的難題,對我國轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)管工作提供了技術(shù)支持.該研究對我國玉米深加工產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易有積極的警示作用.

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