川滇薔薇的種下分類系統(tǒng)和表型變異

吳 ，李慧敏，楊 維，楊錦紅，陳 敏，李進(jìn)昆，蹇洪英

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南昆明650205）

薔薇屬（Rosa L.）的分類系統(tǒng)非常復(fù)雜，這種復(fù)雜性是由演化過程如雜交、基因漸滲等導(dǎo)致的表型、基因型和生態(tài)型的變異和可塑性所共同產(chǎn)生的［1］，這些因素之間又相互關(guān)聯(lián)［2］。薔薇屬植物的表型可塑性給其分類帶來了很大的麻煩，不同的分類系統(tǒng)對(duì)物種數(shù)的認(rèn)定也各不相同，其種下分類更是復(fù)雜。

東喜馬拉雅－橫斷山地區(qū)是薔薇屬植物的分布中心之一，橫斷山地區(qū)分布有薔薇屬植物45個(gè)種、18個(gè)變種和10個(gè)變型［3－4］。川滇薔薇（R.soulieana Crép）是橫斷山地區(qū)的薔薇屬代表植物之一，廣泛分布在海拔2 500～3 700 m的灌叢、山坡、溪邊及農(nóng)地旁，蘊(yùn)藏著對(duì)月季品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新所需的耐干旱［5］、耐貧瘠和花香等重要的優(yōu)異性狀及相關(guān)基因，是一種非常重要的月季種質(zhì)資源［6］。根據(jù)花序中小花數(shù)量、葉片大小及有無毛和有無腺等特征分為川滇薔薇原變種（R.soulieana var.soulieana）、毛葉川滇薔薇（R.soulieana var.yunnanensis）、大葉川滇薔薇（R.soulieana var.sungpanensis）和小葉川滇薔薇（R.soulieana var.microphylla），小葉川滇薔薇和大葉川滇薔薇分別只在西藏八宿和四川松藩有分布，毛葉川滇薔薇主要分布在云南，原變種則在橫斷山地區(qū)廣泛分布［7－8］?！吨袊参镏尽泛汀禙lora of China》均認(rèn)為安徽省金寨縣也有川滇薔薇原變種分布。實(shí)際上，在野外調(diào)查和標(biāo)本查閱中可以發(fā)現(xiàn)川滇薔薇各變種之間的分類特征界限并不明顯，過渡類型較多。那么，現(xiàn)有的種下分類系統(tǒng)是否真實(shí)地反映了川滇薔薇種內(nèi)的遺傳變異？來自安徽的川滇薔薇居群與來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群之間的相互關(guān)系如何？川滇薔薇種內(nèi)的表型變異究竟如何？為了弄清這3個(gè)問題，有必要對(duì)來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群以及來自安徽金寨的川滇薔薇居群進(jìn)行種下分類系統(tǒng)和表型變異研究。

形態(tài)標(biāo)記是檢測(cè)遺傳多樣性大小和分布的傳統(tǒng)標(biāo)記，形態(tài)特征多樣性常被用來估計(jì)居群間或居群內(nèi)的遺傳變異［9］。單拷貝核基因遵循雙親遺傳方式，能提供大量信息位點(diǎn)，且能減少旁系同源（paralog）的影響［10］。本研究利用2個(gè)單拷貝核基因片段：3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、葉綠體表達(dá)的谷氨酰胺合成酶基因（chloroplast－expressed glutamine synthetase，ncpGS）以及43個(gè)形態(tài)特征對(duì)川滇薔薇來自橫斷山地區(qū)的38個(gè)居群和來自安徽金寨的1個(gè)居群進(jìn)行聚類分析，探討川滇薔薇的種下分類系統(tǒng)，同時(shí)研究其表型多樣性及表型變異特征。

1 材料與方法

1.1 研究材料

根據(jù)標(biāo)本記錄，在有標(biāo)本和分布記錄的橫斷山地區(qū)以及安徽省金寨縣進(jìn)行川滇薔薇的標(biāo)本和分子材料采集。采樣策略遵循居群生態(tài)學(xué)采樣的原理和方法［11］，同時(shí)用GPS記錄居群的詳細(xì)信息，如經(jīng)度、緯度和海拔（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 基于單拷貝核基因片段的居群間系統(tǒng)關(guān)系 （1）總DNA提取和PCR擴(kuò)增。每個(gè)居群隨機(jī)選擇1個(gè)個(gè)體，用植物總DNA提取試劑盒（Plant DNA－Easy kit，北京百泰克公司）進(jìn)行所有樣品［包括麗江薔薇（R.lichiangensis Yüet Ku）和野薔薇（R.multiflora Thunb）2個(gè)外類群］總DNA的提取。選擇GAPDH和ncpGS這2個(gè)單拷貝核基因作為目的片段。GAPDH的引物序列為：GPDX7－F，5′－GATAGATTTGGAATT GTTGAGG－3′；GPDX11－R，5′－GACATTGAATGAGATAAA CC－3，PCR反應(yīng)程序參照 Joly等的方法［12］。ncpGS的引物序列為：GScp687－F，5′－GATGCTCACTACAAGGCTTG－3′；GScp994－R，5′－AATGTGCTCTTTGTGGCGAAG－3′［13］，PCR反應(yīng)程序參照Meng等的方法［14］。用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度，最終產(chǎn)物送上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。

（2）數(shù)據(jù)分析。采用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核對(duì)，核對(duì)后的單條序列用 DNAStar（gene codes corporation，USA）進(jìn)行序列拼接，對(duì)于測(cè)序結(jié)果中存在的雜合位點(diǎn)用簡并堿基進(jìn)行代替。從 GeneBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genebank）下載光葉薔薇（R.luciae Franch.et.Roch.）和懸鉤子薔薇（R.rubus Lével.）的相應(yīng)序列。采用 Clustal ver.181［15］對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)，用 BioEdit ver.7.0.4.1軟件［16］進(jìn)行修正。采用 Mega 6.0軟件［17］分別構(gòu)建基于最大似然法的ML樹和最大簡約法的50%一致樹。

1.2.2 基于形態(tài)數(shù)據(jù)的居群間聚類關(guān)系 形態(tài)數(shù)據(jù)的編碼及測(cè)量：根據(jù)《中國植物志》對(duì)薔薇主要是川滇薔薇及其變種的分類特征的描述，選取與枝、刺、葉和花等形態(tài)相關(guān)的43個(gè)表型性狀進(jìn)行編碼，共包含14個(gè)二元性狀、2個(gè)多元性狀和27個(gè)直接數(shù)量性狀。對(duì)含安徽金寨居群在內(nèi)的花和葉形態(tài)特征較完善的31個(gè)居群的所有個(gè)體進(jìn)行形態(tài)特征測(cè)量，測(cè)定值或計(jì)數(shù)值即為編碼（表2）。每個(gè)個(gè)體每個(gè)數(shù)量性狀重復(fù)3次，與葉相關(guān)的性狀以花枝上中間部位的復(fù)葉為測(cè)量對(duì)象；與花相關(guān)的性狀則以完全展開的花朵為測(cè)量對(duì)象。用游標(biāo)卡尺測(cè)定花梗長、萼筒的長與寬，并計(jì)算萼筒的長寬比。

表1 川滇薔薇居群信息

表2 表型性狀及編碼

形態(tài)數(shù)據(jù)分析方法：采用NTSYS pc ver.2.1對(duì)形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后進(jìn)行居群的PCA分析和居群間基于表型的UPGMA聚類。

1.2.3 表型多樣性和居群間表型變異的研究方法 形態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)量方法見“1.2.2”節(jié)，主要用27個(gè)數(shù)量性狀對(duì)根據(jù)單拷貝核基因和表型聚類結(jié)果已確定為川滇薔薇的來自橫斷山的30個(gè)居群的所有個(gè)體進(jìn)行測(cè)量。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行居群各數(shù)量性狀的均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）的統(tǒng)計(jì)，用SAS 9.0軟件進(jìn)行各直接數(shù)量性狀在居群間和居群內(nèi)的方差分析。其中，表型分化系數(shù)的計(jì)算同楊維澤等的方法［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于GAPDH和ncpGS居群間親緣關(guān)系

2.1.1 序列特征 比對(duì)后ncpGS基因數(shù)據(jù)矩陣長700 bp，有

21個(gè)變異位點(diǎn)，其中13個(gè)是信息位點(diǎn)。比對(duì)后的GAPDH基因數(shù)據(jù)矩陣長719 bp，有57個(gè)變異位點(diǎn)，其中28個(gè)是信息位點(diǎn)。2個(gè)片斷聯(lián)合后形成的數(shù)據(jù)矩陣長1 419 bp，有78個(gè)變異位點(diǎn)，其中41個(gè)是信息位點(diǎn)。

2.1.2 居群間系統(tǒng)關(guān)系 從圖1可以看出，來自橫斷山的所有川滇薔薇居群總是單獨(dú)地成為一支，在ML樹中與來自安徽（AH）的材料和懸鉤子薔薇一起成為并系，說明來自安徽的材料可能不屬于川滇薔薇。50%MP一致樹也表明，來自橫斷山的川滇薔薇居群單獨(dú)成為一支，而來自安徽的材料則以50%的靴帶值（bootstrap值）與來自合柱組的其他種單獨(dú)構(gòu)成一支。因此，來自安徽的材料不是川滇薔薇。在川滇薔薇內(nèi)，來自橫斷山的居群并沒有嚴(yán)格地按照地理距離或種下分類系統(tǒng)的4個(gè)變種進(jìn)行聚類。如根據(jù)形態(tài)特征被定名為大葉川滇薔薇的松藩居群（SP）在ML樹和50%MP一致樹中都與被定名為川滇薔薇原變種的丹巴（DB）、黑水（HS）、金川（JC）和馬爾康（MEK）等居群聚在一起；被定名為原變種的小金（XJ）和理縣（LX）等居群又與被定名為毛葉變種的寧蒗（NL）、德欽云嶺（DQyl）等居群聚在一起。

2.2 基于表型性狀的居群間相互關(guān)系

2.2.1 不同居群基于表型性狀的主成分分析 對(duì)含安徽居群在內(nèi)的39個(gè)居群的主成分分析，結(jié)果（表3）表明，對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)最大的是頂端小葉長（TLL）、中部小葉長（MLL）、葉片連柄長（LLPP）、頂端小葉柄長（TLSL）、基部小葉長（BSL）、葉柄長（PTL）、中部小葉寬（MLW）、頂端小葉寬（TLW）、基部小葉寬（BSW）以及花序的小花數(shù)（FNPI）。對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)最大的是花直徑（FLD）、花瓣寬（PTAW）、花瓣長（PTAL）和萼片寬（SPLW）。對(duì)第三主成分貢獻(xiàn)最大的是苞片長（BRL）、苞片寬（BRW）、柱頭長（STL）以及柱頭數(shù)量（STN）。第一主成分的貢獻(xiàn)率為33.26%，第二和第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為18.15%和10.82%，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為62%，說明可以應(yīng)用主成分分析法進(jìn)行39個(gè)居群的表型聚類分析。從圖2可以看出，AH居群與來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群形態(tài)差異較大。AH居群的頂端小葉葉柄長可達(dá)1.06 cm，花梗長1.64 cm，均遠(yuǎn)大于來自橫斷山的川滇薔薇居群。雖然其葉片、頂端小葉葉柄長及花梗長等均較大，但其花部特征偏小，主要是花的直徑小（2.26 cm）、花瓣窄（1.17 cm）、花柱短（0.381 cm）、萼筒近圓形。來自橫斷山地區(qū)的麗江文海（LJwh）、麗江新主（LJxz）、察隅古玉（CYgy）、寧蒗（NL）、鹽源（YY）、康定（KD）、中甸（ZD）和松藩（SP）等居群間關(guān)系較松散，而其他居群之間的表型差異較小、親緣關(guān)系較近。

2.2.2 不同居群基于表型性狀的UPGMA聚類 各居群基于歐氏距離（EUCLID）的聚類結(jié)果（圖3）表明，安徽（AH）群體離其他居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，而分布于橫斷山地區(qū)的其他居群并未嚴(yán)格按地理距離進(jìn)行聚類。雖然部分居群間由于地理距離近且表型相近而聚為一支，但不是所有地理距離相近的居群聚在一起，另有其他與之距離很遠(yuǎn)的居群與之聚在一起，如鹽源、寧蒗和麗江新主居群形成了一個(gè)小分支，與來自康定的居群聚為一支；來自松藩和察隅的居群聚為一支；這2支最后又與來自麗江文海的居群聚為一大支，與來自藏東南和川西的其他居群所構(gòu)成的另一大支并列。來自藏東南和川西的其他居群所構(gòu)成的另一大支也同樣存在類似的情況。由此可見，基于表型性狀的居群間也沒有根據(jù)種下變種進(jìn)行聚類。

2.3 川滇薔薇居群的表型多樣性及表型分化

2.3.1 川滇薔薇表型性狀的變異特征 川滇薔薇27個(gè)直接數(shù)量性狀在居群間的差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01，表4）。與葉相關(guān)的性狀在居群內(nèi)的差異均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），而除花序小花數(shù)（FNPI）外，與花相關(guān)的性狀在居群內(nèi)的差異均不顯著（P＞0.05）?；ㄐ蛐』〝?shù)和皮刺數(shù)量（THN）在居群內(nèi)的變異最大，30個(gè)居群的平均變異系數(shù)分別為59.8%和45.29%，萼片寬（SPW）和葉片小葉數(shù)（LLN）在居群內(nèi)最穩(wěn)定，30個(gè)居群的平均變異系數(shù)分別為11.79%和12.58%。

2.3.2 川滇薔薇群體間的表型分化 川滇薔薇27個(gè)數(shù)量性狀的平均表型分化系數(shù)為66.36%，說明居群間的表型變異是川滇薔薇表型變異的主要來源。刺數(shù)量、近花序葉片小葉數(shù)、萼片長度的表型分化系數(shù)小于50%，表明這些性狀的遺傳變異主要來自于居群內(nèi)，而其他性狀的遺傳變異則主要來源于居群間（表5）。

3 討論與結(jié)論

3.1 川滇薔薇是橫斷山地區(qū)的特有種，安徽沒有川滇薔薇分布

《中國植物志》和《Flora of China》都認(rèn)可安徽有川滇薔薇的分布［7－8］，但王春景等通過對(duì)有關(guān)資料記錄和標(biāo)本的查看，實(shí)地調(diào)查走訪卻并未采到實(shí)物［19］。本研究所采用的安徽居群采自北京植物所標(biāo)本管（PE）的川滇薔薇標(biāo)本記錄地點(diǎn)。基于2個(gè)單拷貝核基因的居群間系統(tǒng)關(guān)系表明，來自安徽的材料與其他38個(gè)來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群的遺傳距離較遠(yuǎn)。雖然支持率不高，但ML樹、50%的MP嚴(yán)格一致樹均顯示其不屬于川滇薔薇，與川滇薔薇、懸鉤子薔薇、野薔薇和麗江薔薇成為并系。在基于表型性狀的聚類分析和主成分分析中，來自安徽的材料與其他來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇相距很遠(yuǎn)。此外，由于有報(bào)道的安徽省內(nèi)分布的薔薇屬合柱組全緣托葉系只有川滇薔薇、軟條七薔薇、瑯琊薔薇（R.langyashanica）和懸鉤子薔薇［19］，其中瑯琊薔薇的葉片邊緣有較深的尖銳鋸齒，軟條七薔薇的小葉多為3～5個(gè)，且較大、容易識(shí)別，懸鉤子薔薇與川滇薔薇從現(xiàn)有的檢索表中進(jìn)行檢索時(shí)常因葉背有無毛等容易誤判。因此，川滇薔薇是橫斷山地區(qū)的特有種，安徽沒有川滇薔薇分布，以前被認(rèn)為是川滇薔薇的來自安徽的標(biāo)本可能是懸鉤子薔薇。

表3 表型性狀主成分分析中前3位主成分的特征根和特征向量

3.2 川滇薔薇基于單拷貝核基因和形態(tài)特征的種下分類系統(tǒng)

Stebbins指出，“植物分類引用了亞種、變種、變型等種下單位，這種分類方法所造成的混亂多于它所要澄清的混亂”［20］。其中，變種是指具有形態(tài)生理、遺傳特征差異但在地理分布上可能重疊的群體，有時(shí)也指未弄清地理分布的亞種。

隨著進(jìn)化植物學(xué)的發(fā)展，種下分類越來越比較客觀地反映出植物各類群間的親緣關(guān)系，尤其是種下分類單位，從居群遺傳和變異的角度闡釋得更加清楚［21］。根據(jù)居群間基于核基因和形態(tài)特征的聚類分析以及形態(tài)特征的PCA分析可知，根據(jù)葉片等表型性狀來進(jìn)行的川滇薔薇種下分類系統(tǒng)并不能反映其種內(nèi)的遺傳變異。表型聚類除來自安徽的材料外，其他30個(gè)居群直接聚類成兩大支。第一大支與第二大支的主要區(qū)別在于花序上的花朵數(shù)和小葉片大小。第一大支的花朵數(shù)都在10朵以上，葉片中部和頂端小葉片長于2 cm，然而居群間基于核基因的聚類既沒有反映形態(tài)變異，也沒有按照地理距離進(jìn)行。這可能是由于川滇薔薇主要分布在橫斷山地區(qū)的干暖河谷及其支流河岸，有時(shí)也延伸到海拔3 700 m以下的山坡路邊和灌叢中。雖然河流和峽谷有利于川滇薔薇同一流域的居群間基因交流和遷移，但分布于同一流域不同緯度、不同海拔即使具有相同或相近的遺傳背景（基因型）的居群及個(gè)體，也會(huì)由于對(duì)環(huán)境的適應(yīng)而形成許多不同的形態(tài)特征。

表4 川滇薔薇各居群表型性狀的變異系數(shù)

續(xù)表4

表5 川滇薔薇直接表型數(shù)量性狀的方差分量及群體間分化系數(shù)

3.3 川滇薔薇的表型多樣性和表型分化

表型差異可能并不與潛在的基因突變數(shù)目成比例。性狀的表達(dá)主要取決于性狀本身，取決于是單基因或是多基因控制。此外，對(duì)薔薇屬植物來說，其發(fā)育階段、對(duì)環(huán)境的可塑性程度等對(duì)表型差異的影響并非一成不變［22］。唐開學(xué)等分別對(duì)川滇薔薇、峨眉薔薇（R.omeiensis Rolfe）、大花香水月季［R.odorata（Andr.）Sweet var.gigantea（Crép.）Rehd.etWils.］和中甸刺玫（R.praelucens Byhouwer）等分布于云南的居群進(jìn)行基于表型性狀的多樣性研究，結(jié)果顯示，它們的表型在居群間和居群內(nèi)均存在豐富的變異，但不同物種的表型變異與地理距離之間的關(guān)系不同。其中，川滇薔薇在云南省內(nèi)幾個(gè)居群的表型多態(tài)性豐富，變異主要來源于居群間［23－26］。本研究中，川滇薔薇整個(gè)分布區(qū)30個(gè)居群的27個(gè)表型性狀觀測(cè)值差異均達(dá)到極顯著水平，變異系數(shù)變幅為 11.79% ～5980%。川滇薔薇存在豐富的表型多樣性，表型分化系數(shù)為66.36%，說明居群間的表型變異是川滇薔薇表型變異的主要來源，再次表明在橫斷山地區(qū)因其特殊的環(huán)境特點(diǎn)，廣泛分布的川滇薔薇表型在種內(nèi)分化劇烈，居群間存在顯著的表型變異。這種變異是否是其遺傳變異的完全體現(xiàn)，尚待進(jìn)一步通過分子水平的遺傳多樣性進(jìn)行研究驗(yàn)證。

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