頭發(fā)誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生蛋白的初步研究

黎曉麗 ，賴維 ，劉麗 ，陳劍

（1廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州510623；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630；3河南省濮陽市油田總醫(yī)院，河南 濮陽 457001）

頭癬是一類真菌感染頭皮、毛發(fā)的疾病，成人、兒童均可發(fā)病。頭癬傳染性強，呈世界性分布，散發(fā)或流行，可造成永久性脫發(fā)和頭皮瘢痕，破壞美觀，影響患者心理和社交[1]。頭癬按病原菌種類可分為3類：黃癬、白癬、黑點癬。真菌雖然種類繁多，但能致頭癬的真菌較少，如皮膚癬菌中部分毛癬菌和小孢子菌是頭癬主要致病菌；皮膚癬菌中的絮狀表皮癬菌，以及霉菌、念珠菌不易致頭癬[2-3]。目前為止，頭癬確切的發(fā)病機制及致病過程尚不清楚。

近年由于飼養(yǎng)家庭寵物及經(jīng)濟動物的增多，以及廣譜抗生素、免疫抑制劑、生物制劑等藥物的運用，頭癬發(fā)病率有所回升[4]。既往認為真菌致頭癬可能與其形態(tài)轉(zhuǎn)變和宿主免疫有關(guān)[5]，隨著對蛋白酶作為真菌毒力因子之一的研究深入，推測頭癬致病可能與蛋白酶有關(guān)，因此，本研究將真菌分為2組：頭癬致病菌組和非致病菌組，采用體外液體誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，初步了解真菌在體外侵襲毛發(fā)后所致毛發(fā)的改變和所釋放出的總蛋白量，釋放出的蛋白作為蛋白酶分解的產(chǎn)物，與釋放的蛋白酶正相關(guān)，通過對比總蛋白量初步判定各組蛋白酶的活性大小，為闡明頭癬發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 致病菌組：斷發(fā)毛癬菌、許蘭毛癬菌、石膏樣小孢子菌、須癬毛癬菌，紅色毛癬菌。

非致病菌組：短帚霉、絮狀表皮癬菌。

對照組：①只加緩沖液及頭發(fā)，不加真菌；②只加緩沖液及真菌，不加頭發(fā)。毛發(fā)為未焗油的健康兒童頭發(fā)，經(jīng)高壓消毒滅菌。

1.2 誘導(dǎo)緩沖液MgSO4（0.5g/L），K2HPO4（0.46g/L），KH2PO4（1.0 g/L），氯霉素注射液0.1 g/L，pH為7.0。

1.3 受試菌株的培養(yǎng) 將受試菌株在沙堡培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌落成熟，挑取適量菌配成濃度為5×106CFU/mL的菌懸液（產(chǎn)孢多菌-斷發(fā)毛癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、短帚霉只取孢子；產(chǎn)孢少菌-絮狀表皮癬菌、許蘭毛癬菌取菌絲），取5 mL接種于含頭發(fā)0.2 g的液體培養(yǎng)基（每瓶含25 mL緩沖液）,25℃培養(yǎng)20周。

1.4 培養(yǎng)后上清液BCA法檢測所含的總蛋白量

1.4.1 主要試劑盒、儀器 BCA蛋白定量標準試劑盒，酶標儀，光學(xué)顯微鏡。

1.4.2 實驗主要步驟

1.4.2.1 觀察培養(yǎng)后真菌菌量增長情況，光學(xué)顯微鏡下觀察20周后各組頭發(fā)改變。

1.4.2.2 配制BSA標準溶液-配制BCA工作液-加入標準蛋白樣品及待測樣品-酶標儀測定OD值-根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 兩獨立樣本比較的秩和檢驗，統(tǒng)計軟件為SPSS 22.0。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)后真菌生長情況 紅色毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、石膏樣小孢子菌、須癬毛癬菌：菌絲多，包饒毛發(fā)。絮狀表皮癬菌、短帚霉、許蘭毛癬菌：菌絲少，不包饒毛發(fā)。

2.2 各組毛發(fā)的變化 ①斷發(fā)毛癬菌：大部分毛小皮掀起，毛刷狀。②許蘭毛癬菌：毛發(fā)外觀基本完好，極少毛小皮掀起。③石膏樣小孢子菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀，部分有穿孔，部分形態(tài)完全破壞。④須癬毛癬菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀，部分有穿孔，部分形態(tài)完全破壞。⑤紅色毛癬菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀。⑥短帚霉：少數(shù)毛小皮掀起。⑦絮狀表皮癬菌：少數(shù)毛小皮掀起。

2.3.1 20周后所得蛋白濃度 見表1。

2.3.2 秩和檢驗頭癬致病菌組和非致病菌組總蛋白量，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 20周后頭發(fā)變化情況

表1 20周后所得蛋白濃度g/L

圖2 誘導(dǎo)后所得總蛋白量對比圖（單位：g/L）

3 討論

1963年Mercer等[6]發(fā)現(xiàn)感染頭發(fā)的須癬毛癬菌菌絲頂端的穿透器官可分泌出某種物質(zhì)破壞頭發(fā)的二硫鍵，從而逐漸消化頭發(fā)，現(xiàn)這種物質(zhì)被證實為蛋白酶。蛋白酶是皮膚癬菌致病的重要毒力因子，與其獲得營養(yǎng)、擴大侵襲及誘導(dǎo)宿主免疫相關(guān)[7-8]。蛋白酶可分為酸、堿兩類酶，多種真菌均可產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶的產(chǎn)生也需要底物的誘導(dǎo)，角蛋白底物誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生蛋白酶會因底物或真菌種類的不同而不同[9]。Okafor等[10]曾對5種皮膚癬菌進行釋放蛋白量的測定，結(jié)果顯示所有受試皮膚癬菌均能降解頭發(fā)，以石膏樣小孢子菌最強，奧杜央小孢子菌最弱。Katiyar等[11]對比分離出的12種真菌以頭發(fā)誘導(dǎo)30 d后釋放的蛋白量，發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌釋放蛋白量和對頭發(fā)破壞程度均比枝頂孢霉高。本實驗以兒童頭發(fā)為唯一氮源，采用體外液體培養(yǎng)方法對比釋放的總蛋白量，20周后所測得的蛋白是因蛋白酶分解頭發(fā)角蛋白而來，總量與蛋白酶活性成正相關(guān)，通過對比總蛋白量可初步對比真菌蛋白酶的活性，結(jié)果顯示上清液中總蛋白量有差異，表明各種真菌誘導(dǎo)后蛋白酶活性不同，與既往國外實驗結(jié)果一致；結(jié)合另外兩個方面（毛發(fā)改變及真菌菌量變化）對比不同真菌對頭發(fā)的降解力，證實了相同底物對蛋白酶水解的抵抗力有差異。

實驗發(fā)現(xiàn)，第1組中許蘭毛癬菌蛋白量、毛發(fā)改變在所有受試菌中最小，并且該菌不能從毛小皮處穿入頭發(fā)，推測黃癬致病與毛干誘導(dǎo)的蛋白酶無關(guān)，而黃癬患者真菌鏡檢可見到發(fā)內(nèi)及痂內(nèi)均有孢子和菌絲，黃癬菌可能是先經(jīng)皮膚或毛囊處感染，隨著頭發(fā)向外生長，真菌也被帶出毛囊。絮狀表皮癬菌和短帚霉蛋白量均低，毛發(fā)破壞輕，表明其對頭發(fā)的侵襲力差，所以臨床表現(xiàn)為不致頭癬。另外，頭癬致病菌除黃色毛癬菌外，均可將毛干分解為可溶性蛋白，筆者推測蛋白酶與黑點癬、白癬的發(fā)病有關(guān)，這一點尚有待擴大樣本量來進一步證實。

總之，通過筆者以上研究發(fā)現(xiàn)，真菌在體外能分解頭發(fā)使其釋放出可溶性蛋白供真菌生長繁殖。各種真菌對頭發(fā)的分解力有差異，頭癬非致病菌對頭發(fā)分解力均差，但并非所有頭癬致病菌都顯示強的頭發(fā)分解能力，比如許蘭黃癬菌，推測真菌蛋白酶可能參與某些類型頭癬致病，但并不是唯一決定因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于角蛋白富含胱氨酸二硫鍵，其水解除了蛋白酶，還需半胱氨酸雙加氧酶及亞硫氨酸鹽流出泵的參與，前者還參與酵母形態(tài)到菌絲形式的過渡，并且是半胱氨酸氧化成半胱氨酸磺酸的關(guān)鍵，對亞硫酸鹽的產(chǎn)生和分泌有重要作用，亞硫酸鹽作為還原劑，可將部分角蛋白的胱氨酸二硫鍵裂解，因此半胱氨酸雙加氧酶作為皮膚癬菌的另一致病因子成為一項研究熱點[12-13]。真菌頭癬致病的具體過程，其如何感染、生存，以及與宿主免疫、內(nèi)環(huán)境的關(guān)系，值得進一步研究。

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