養(yǎng)血祛風(fēng)湯對特應(yīng)性皮炎小鼠模型血清IgE、IL-4和IFN-γ的影響

汪洋，陳志偉，陳信春，朱文政，周翹楚，葉藤

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江溫州325000）

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，患者往往瘙癢劇烈，嚴重影響生活質(zhì)量。本病的患病率呈上升趨勢，2012我國年上海地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，3～6歲兒童患病率達8.3%（男8.5%，女 8.2%），城市顯著高于農(nóng)村（10.2%∶4.6%）[1]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療本病上有著悠久的歷史及理論經(jīng)驗，藥物的安全性、有效性也得到了廣大醫(yī)患的認可。故筆者選用臨床治療AD療效滿意的經(jīng)驗方“養(yǎng)血祛風(fēng)湯”進行實驗研究。研究擬通過觀察本方對AD動物模型皮損以及血清IgE、白細胞介素（IL）-4、干擾素（IFN）-γ水平的影響，探討其在AD治療中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取6周大清潔級BALB/c雄性小鼠30只，體質(zhì)量（20±2）g，溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。先飼養(yǎng)1周，房間溫度保持在（23±3）℃，濕度在50%左右，照明時間為8點～20點，自由取食。

1.1.2 藥物與試劑 藥物：養(yǎng)血祛風(fēng)湯（茯苓、炒白術(shù)、白扁豆、薏苡仁、當(dāng)歸、黃芪、大血藤、荊芥、防風(fēng)、僵蠶、白鮮皮、蒼術(shù)、萆薢、黃芩、生甘草）浸泡30 min，煮沸后煎20 min，共煎2次，合并煎液、過濾、濃縮至1 g生藥/mL（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供）。試劑：生理鹽水，2，4-二硝基氟苯（DNFB，石家莊鑫兆陽化工科技有限公司），丙酮，橄欖油，小鼠 IgE、IL-4、IFN-γ ELISA 試劑盒（Multi－Sciences公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 從30只小鼠中隨機選取8只，進行正常飼養(yǎng)，余22只小鼠造模。參考文獻[2] ，剃去背部毛發(fā)，面積約2.0 cm×3.0 cm。造模第1天采用 0.5%DNFB（丙酮∶橄欖油=4∶1）50 μL，使用毛刷均勻涂抹在小鼠背部剃毛區(qū)，連續(xù)2 d，第5天后改用 0.2%DNFB（丙酮∶橄欖油=4∶1）50 μL 涂于小鼠背部剃毛區(qū)，2次/周，連續(xù)4周。

1.2.2 皮損觀察及組織病理 小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、結(jié)痂、苔蘚化等改變，同時隨機選取2只模型小鼠，在皮損處進行組織病理檢查，觀察是否符合AD病理改變。小鼠取血后再次取對照組與實驗組小鼠皮損處皮膚，觀察病理改變。

1.2.3 分組及給藥 造模成功后將剩余小鼠隨機分成2組，對照組（生理鹽水組）、實驗組（養(yǎng)血祛風(fēng)湯組）每組10只。各組灌飼相應(yīng)藥物，正常飼養(yǎng)的小鼠設(shè)為空白組，灌飼生理鹽水，劑量約為臨床成人用量的10倍，按25 mL/kg體質(zhì)量計算，1次/d，連續(xù)15 d。

1.2.4 檢測指標(biāo)及方法 停藥24 h后取材：摘除小鼠眼球，獲得小鼠全血約0.5 mL，室溫放置2 h后3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，獲取血清，于-20℃中保存，ELISA法檢測血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部皮損表現(xiàn) 造模后小鼠背部皮膚可見紅斑、干燥、脫屑、結(jié)痂等皮損改變，見圖1。治療15 d后實驗組痂皮脫落，皮膚紅斑及鱗屑基本消失，并出現(xiàn)黃色厚薄不一的痂皮，見圖2。對照組小鼠痂皮部分脫落，仍有紅斑、脫屑，苔蘚化，見圖3。

2.2 皮膚組織病理改變 造模后小鼠皮膚病理：可見角質(zhì)層不規(guī)則角化過度及角化不全，局灶伴漿液性滲出；棘細胞層增厚，見海綿水腫及細胞內(nèi)水腫；基底液化變性；真皮淺中層血管周見中等程度以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，可見明顯紅細胞外溢，見圖4。

圖1 造模后皮損

圖2 治療后實驗組皮損

圖3 治療后對照組皮損

圖4 造模后小鼠皮膚病理（HE染色×200）

取血后小鼠皮膚病理：對照組：表皮可見棘細胞層增厚，輕度海綿水腫及細胞內(nèi)水腫；基底局灶可見空泡變性或液化變性；真皮淺層血管周見輕度以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤及紅細胞外溢，符合皮膚慢性炎癥性改變，見圖5；實驗組：表皮可見棘細胞層稍增厚，輕度海綿水腫；真皮淺層見少量淋巴細胞浸潤，無紅細胞外溢，較對照組炎癥改變減輕，見圖6。

圖5 取血后對照組小鼠皮膚病理（HE染色×200）

圖6 取血后實驗組小鼠皮膚病理

2.3 血清IgE、IL-4、IFN-γ水平 與空白組相比，對照組 IgE 水平顯著升高（t=3.66，P＜0.01）；IL-4水平顯著升高（t=3.36，P＜0.01）；IFN-γ 水平下降（t=2.87，P＜0.05）；與對照組相比，實驗組 IgE 水平顯著降低（t=2.52，P＜0.05）；IL-4水平顯著降低（t=2.97，P＜0.01）；IFN-γ 水平升高（t=2.47，P＜0.05）。見表 1。

表1 3 組血清 IgE、IL-4、IFN-γ 水平 （±s）

表1 3 組血清 IgE、IL-4、IFN-γ 水平 （±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；實驗組與對照組比較，△P<0.05。

組別 n IgE（ng/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ（pg/mL）空白組 8 37.45±41.91* 1.28±0.80* 27.54±8.28*實驗組 10 80.65±58.08△ 1.56±0.92△ 25.94±9.29△對照組 10 168.86±94.01*△ 3.07±1.32*△ 16.16±8.41*△

3 討論

學(xué)者們在動物模型建立的反復(fù)實驗中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用DNFB刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生慢性炎癥性皮膚改變，與人類AD的病理學(xué)及免疫性特征較為相似[3-4]，故本研究采用此方法建立AD動物模型，通過觀察養(yǎng)血祛風(fēng)湯對動物模型皮損變化、病理改變及血液中細胞因子的影響來探討本方對AD作用。結(jié)果實驗組小鼠皮損及病理的炎癥性改變明顯輕于對照組，表明本方有改善AD皮損的作用。

AD的發(fā)病機制尚不完全清楚，一般認為是在遺傳因素基礎(chǔ)上，由于變應(yīng)原進入和微生物定植（如金黃色葡萄球菌和馬拉色菌），形成皮膚免疫異常反應(yīng)和炎癥。而AD的異常免疫反應(yīng)涉及多個環(huán)節(jié)，如朗格漢斯細胞和皮膚樹突細胞對變應(yīng)原的提呈、Th2為主的異常免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)性T細胞功能障礙、IgE過度產(chǎn)生等[5]。許多研究表明AD患者中存在Th1/Th2失衡[6-7],在急性期以Th2細胞反應(yīng)為主，活化的Th2細胞通過釋放IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgE；在慢性期時，以Th1細胞因子為主，包括Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-β、IL-2等細胞因子，參與細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究中對照組與空白組比較IgE、IL-4均顯著增高，IFN-γ降低，實驗組與對照組比較IgE、IL-4明顯下降，IFN-γ升高。表明小鼠模型符合AD的免疫學(xué)改變，同時提示養(yǎng)血祛風(fēng)湯有降低IgE、IL-4水平，升高IFN-γ水平，調(diào)節(jié)AD Th1/Th2因子失衡的作用，從動物實驗中證實本方有治療AD的作用。

AD屬于中醫(yī)“四彎風(fēng)”范疇，因稟性不耐或脾虛濕盛所致，主要分為血虛風(fēng)燥、風(fēng)濕蘊膚兩型[8]，血虛風(fēng)燥表現(xiàn)為皮膚干燥肥厚，瘙癢抓痕血痂，以慢性表現(xiàn)為主，風(fēng)濕蘊膚表現(xiàn)為皮膚潮紅，瘙癢劇烈，抓之可糜爛滲出，以急性表現(xiàn)為主，而臨床中AD又往往在兩型之間反復(fù)，很難截然分開，方中炒白術(shù)、白扁豆、薏苡仁健脾以除濕，治脾虛之本，茯苓、萆薢、蒼術(shù)、黃芩祛濕以健脾，治濕邪之標(biāo)；當(dāng)歸、黃芪、大血藤，補氣養(yǎng)血活血以治血虛生風(fēng)之本，荊芥、防風(fēng)、僵蠶、白鮮皮祛風(fēng)以止癢，以治風(fēng)邪瘙癢之標(biāo)；生甘草補脾益氣、調(diào)和諸藥，本方諸藥合用既可養(yǎng)血祛風(fēng)，又可健脾除濕，標(biāo)本兼治，攻補兼施。臨床中可根據(jù)病癥，調(diào)整藥量以達到滿意療效。

參考文獻：

[1] Xu F,Yan S,Li F,et al.Prevalence of childhood atopic dermatitis:an urban and rural community-based study in Shanghai,China[J/OL] .PLoS One,2012,7:e36174.

[2] Li YZ,Lu XY,Jiang W,et al.Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model[J] .Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:907016.

[3] Inagaki N,Nagai H.Analysis of the mechanism for the development of allergic skin inflammation and the application for its treatment:mouse models for the development of remedies for human allergic dermatitis[J] .J Pharmacol Sci,2009,110:251-259.

[4] Samukawa K,Izumi Y,Shiota M,et al.Red ginseng inhibits scratching behavior associated with atopic dermatitis in experimental animal models[J] .J Pharmacol Sci,2012,118:391-400.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會免疫學(xué)組、特應(yīng)性皮炎協(xié)作研究中心.中國特應(yīng)性皮炎診療指南（2014版）[J] .中華皮膚科雜志,2014,47（7）:511-514.

[6] Nograles KE,Zaba LC,Shemer A,et al.IL-22-producing“T22”T cells account for upregulated IL-22 in atopic dermatitis despite reduced IL-17-producing TH17 T cells[J] .J Allergy Clin Immunol,2009,123:1244-1252.

[7] Gittler JK,Shemer A,Suárez-Fari?as M,et al.Progressive activation of T（H）2/T（H）22 cytokines and selective epidermal proteins characterizes acute and chronic atopic dermatitis[J] .J Allergy Clin Immunol,2012,130:1344-1354.

[8] 國家中醫(yī)藥管理局.中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)[Z] .1994,06.